- •Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой
- •Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-
- •Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-
- •Глава III
- •Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
- •Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
- •Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
- •Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
- •Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
- •Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
- •Глава X.
- •Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси-
- •Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-
- •Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен-
- •Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-
- •Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг-
- •Глава I
- •Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
- •Глава VI.
- •Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
- •Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
- •Раздел 6.3 Анализ трансляции, днк-экспрессионные систе-
- •Глава II). После секвенирования кДнк можно, исходя из гене-
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Раздел 8.1. Генетические линии животных.
- •Раздел 8.2. Трансгенные животные.
- •Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
- •Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
- •Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
- •Глава iy.
- •Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
- •Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных
- •Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
- •Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-
- •Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
- •Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
- •Глава I. Структура и методы анализа днк.
- •Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
- •Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
- •Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
- •Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
- •Глава VII.
- •Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
- •Раздел 7.2. Днк-диагностика при различных типах насле-
- •Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
- •Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
- •Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
- •Глава IX.
- •Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-
- •Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
- •Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
- •Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
- •Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-
- •Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:
- •Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы
Глава III
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
сцепления.
Генетические карты определяют хромосомную принадлеж-
ность и взаимное расположение различных компонентов генома
относительно друг друга. Возможность построения таких карт
обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:
линейным характером локализации генов в хромосомах (это оп-
ределяется линейностью молекулы ДНК) и относительной ста-
бильностью расположения облигатных элементов генома в преде-
лах вида. При построении генетических карт используют разные
подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генети-
ческого сцепления на основе определения частот мейотической
рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей
наследования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными
перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или
поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гиб-
ридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или
несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой
целью используют механический сортинг целых хромосом и даже
их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют
привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к
определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весь-
ма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, мето-
дов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать
отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до
одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа
осуществляют физическое картирование последовательностей
ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем
проводят идентификацию в этих последовательностях транскри-
бируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и
клонированием соответствующих им полноразмерных молекул
кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры гено-
ма завершается построением карт генов, различающихся по еди-
ницам измерения расстояний между отдельными элементами этих
карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на
различных участках генома. Соответственно различают карты
сцепления, генетические карты, цитогенетические карты инди-
видуальных хромосом и физические или молекулярные карты оп-
ределенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентифика-
ции отдельных элементов генома, то есть определения их гра-
ниц, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо
совмещение всех типов карт в местах локализации этих элемен-
тов.
Первым шагом на пути построения генетических карт явля-
ется формирование групп сцепления генов, контролирующих
различные наследственные признаки, и исследование их взаим-
ного расположения в этих группах. На следующем этапе опре-
деляют соответствие между генетическими группами сцепления
и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их
фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом прово-
дят с использованием методов дифференциальной окраски
(см.раздел 3.2). По мере появления все большего числа лока-
лизованных признаков эффективность построения генетических
карт значительно возрастает, так как увеличивается число
маркированных участков хромосом и, таким образом, появля-
ется возможность комбинированного использования различных
экспериментальных подходов для более подробного исследова-
ния этих участков.
Принципиальная схема картирования неизвестных генов,
представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Вы-
яснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих
маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-
тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование набора
фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выде-
ление из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые
ДНК-последовательности, предположительно соответствующие
гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-
нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и
идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).
Рассмотрим подробнее эту схему.
Построение карт сцепления основано на изучении про-
цессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в
мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хро-
мосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от
родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)
составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером
расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редук-
ционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,
рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена
участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в
мейозе (Рис.3.2). При этом порядок генов не нарушается, но
в потомстве могут появиться новые комбинации родительских
аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами за-
висит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены
друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта ве-
роятность меньше.
Оценку сцепления между генами проводят на основании
статистического анализа сегрегации признаков в семьях с
разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют
метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть
подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the
odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероят-
ности наблюдаемой родословной при условии, что два гена
сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии
сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализо-
ваны в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная
оценка соответствует максимальному значению lod. При значе-
ниях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в раз-
ных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста-
тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью
компьютерных программ, наиболее известные из которых прог-
раммы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;
Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления
расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).
1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че-
ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав-
ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,
можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1
миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма
приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и
реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз-
личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие
точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби-
нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро-
мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из-
вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем
у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в
единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра-
зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен-
тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,
выражаемом в парах нуклеотидов.