Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-

тантных ДНК.

Идентификация мутантных аллелей, то есть обнаружение

нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК,

является самым прямым методом молекулярной диагностики

наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции,

дупликации, инверсии, транслокации - размером более 1 Мb,

затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут

быть обнаружены на цитологических препаратах с использовани-

ем техники высокого разрешения хромосомного анализа (анализ

дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще боль-

шая разрешающая способность (до 50 кb) может быть достигнута

при работе на специальным образом приготовленных (растяну-

тых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибри-

дизации in situ (FISH - Глава II).

Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов,

могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной

геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях гене-

тического анализа, предшествующих молекулярному клонированию

гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяжен-

ные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные

делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации,

локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием ре-

ализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мута-

ций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью ге-

на, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной

ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную

ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепя-

щими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибриди-

зации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (Глава I) и

проводят сравнительный анализ расположения бэндов на ради-

оавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рест-

риктазы Msp1 и Taq1, которые узнают сайты CGGG и TGGA, соот-

ветственно. Благодаря наличию СpG последовательностей эти

сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию

(см.раздел 4.5). Наличие протяженных делеций, либо точечных

мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров

рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других то-

чечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и неболь-

ших структурных аномалий возможен только для клонированных

генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых

участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основа-

ны, главным образом, на использовании полимеразной цепной

реакции в её различных модификациях (см.Главу I, а также

разделы 4.5 и 4.6).

Для анализа мутантных аллелей, прежде всего, необходимо

иметь изолированные последовательности мутантного гена, ко-

торые могут быть получены либо путем клонирования или ампли-

фикации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплифи-

кации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей

гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК паци-

ентов (Рис. 4.2). В первом случае отбирают клонированные

к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг

кДНК-овых библиотек, сконструированных из специфических тка-

ней или культур клеток больного. При этом в качестве зондов

используют кДНК-овые последовательности нормального гена.

Другим источником кодирующих последовательностей мутантного

гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих

тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем

специфической амплификации перекрывающихся последователь-

ностей кодирующих областей гена, используя в качестве матри-

цы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изо-

лированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то,

что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей,

нуклеотидные последовательности которых, как правило, стано-

вятся известны вскоре после идентификации и клонирования ге-

на. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в свя-

зи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых

происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Од-

нако, обнаружение следовых количеств, так называемой, неза-

конной или эктопической мРНК во многих клетках и тканях, в

том числе в клетках крови, позволяет преодалевать и эти

трудности (Kaplan et al., 1992). Успех подобной процедуры

получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разра-

боткой эффективных методов выделения и обратной транскрипции

мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых

соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях

(например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна

(см.Главу X). Единственным принципиальным ограничением мето-

дов детекции мутаций в кДНК-овых последовательностях явля-

ются невозможность выявления мутаций в регуляторных и инт-

ронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены

только при анализе геномной ДНК пациента.

Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет

сложностей, так как она может быть изолирована из любых кле-

ток или тканей больного независимо от характера экспрессии

исследуемого гена. Однако, амплификация целых экзонов воз-

можна только при знании нуклеотидных последовательностей

фланкирующих интронных областей, из которых и производят

подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов

представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную

далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ог-

раничениям этого подхода следует отнести необходимость

достаточно полной информации о структуре гена и о его пер-

вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом

тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области

гена, отсюда для получения более полной информации необходи-

ма амплификация многих экзонов.

Стратегия идентификации мутаций может быть различной и,

в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее

неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини-

рование уже известных мутаций. В первом случае обектом

исследования чаще всего служат клонированные или амплифици-

рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку-

лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи-

руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.