- •Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой
- •Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-
- •Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-
- •Глава III
- •Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
- •Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
- •Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
- •Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
- •Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
- •Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
- •Глава X.
- •Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси-
- •Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-
- •Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен-
- •Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-
- •Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг-
- •Глава I
- •Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
- •Глава VI.
- •Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
- •Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
- •Раздел 6.3 Анализ трансляции, днк-экспрессионные систе-
- •Глава II). После секвенирования кДнк можно, исходя из гене-
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Раздел 8.1. Генетические линии животных.
- •Раздел 8.2. Трансгенные животные.
- •Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
- •Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
- •Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
- •Глава iy.
- •Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
- •Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных
- •Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
- •Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-
- •Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
- •Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
- •Глава I. Структура и методы анализа днк.
- •Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
- •Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
- •Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
- •Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
- •Глава VII.
- •Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
- •Раздел 7.2. Днк-диагностика при различных типах насле-
- •Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
- •Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
- •Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
- •Глава IX.
- •Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-
- •Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
- •Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
- •Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
- •Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-
- •Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:
- •Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы
Глава IX.
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.
Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-
мы генной терапии.
В широком смысле слова генная терапия означает лечение
путем введения в ткани или в клетки пациента смысловых пос-
ледовательностей ДНК. Первоначально генная терапия рассмат-
ривалась как возможность исправления дефекта в гене. Счита-
лось, что основным обьектом для такого лечения будут служить
моногенные наследственные заболевания человека, причем тео-
ретически представлялась вероятной коррекция генного дефекта
как на соматическом уровне, так и на уровне зародышевых (по-
ловых) клеток. Многочисленные эксперименты по созданию
трансгенных животных, начатые после 1980 г., а также на
культурах клеток внесли существенные коррективы в эти теоре-
тические представления. Во-первых, оказалось значительно
проще исправлять не сам дефект в гене, то есть заменять весь
мутантный ген или его мутированный фрагмент на нормальный, а
вести коррекцию путем введения в организм пациента полноцен-
но работающего гена (обычно его кДНК). Во-вторых, несмотря
на решающие успехи генной инженерии последних лет, исследо-
вания по геннной терапии у человека осуществляются исключи-
тельно на соматических тканях, в которых в норме происходит
экспрессия дефектного гена. Генная терапия на уровне половых
и зародышевых клеток человека ввиду возможных серьезных пос-
ледствий для генофонда человечества представляются весьма
проблематичной и на данном этапе наших знаний - малореаль-
ной. И наконец, в-третьих, уже разработанная и применяемая
на практике методология генной терапии оказалась пригодной
для лечения не только моногенных наследственных заболеваний,
но и таких широко распространенных болезней, какими являются
злокачественные опухоли, многие виды тяжелых вирусных инфек-
ций, включая спид, сердечно-сосудистые и другие заболевания.
Учитывая эти обстоятельства, генную терапию на современном
этапе можно определить как лечение наследственных, онкологи-
ческих, некоторых инфекционных (вирусных) и других заболева-
ний путем введения генов в клетки пациентов с целью направ-
ленного изменения генных дефектов, либо придания клеткам но-
вых функций (Culver, 1994). Первые клинические испытания ме-
тодов генной терапии были предприняты 22 мая 1989г. с целью
генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов
в случае прогрессирующей меланомы. Маркированные прокариоти-
ческим геном neo, Т-лимфоциты были устойчивы к неомицину и
могли быть легко отселектированы в культуре, что позволило
детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное
накопление в опухолях (подробней см. 9.5).
Первым моногенным наследственным заболеванием, в отно-
шении которого были применены методы генной терапии, оказал-
ся наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в
гене аденозин-дезаминазы. 14 сентября 1990г.в Бетезде (США)
4-х летней девочке, страдающей этим достаточно редким забо-
леванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лим-
фоциты, предварительно трансформированные ex vivo геном ADA
(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект
наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процеду-
ра была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Anderson, 1992;
Culver, 1994). В течение 3-х лет терапии в общей сложности
проведено 23 внутривенных трансфузии ADA-трансформированных
Т-лифоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В резуль-
тате лечения состояние пациентки (Ашанти В. ДеСильва) нас-
только улучшилось, что она смогла вести нормальный образ
жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным
оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием
(подробней см. раздел 9.5). В настоящее время клинические
испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Ита-
лии, Франции, Великобритании и Японии.
Другие моногенные наследственные заболевания, в отноше-
нии которых уже имеются официально разрешенные протоколы и
начаты клинические испытания, касаются семейной гиперхолес-
теринемии (1992); муковисцидоза (1993); гемофилии В (1992);
болезни Гоше (1993). В отношении многих других заболеваний
медицинские протоколы клинических испытаний находятся в ста-
дии утверждения (см. раздел 9.5.). К 1993г. только в США к
клиническим испытаниям генно-инженерных конструкций на чело-
веке было допущено 53 проекта (Culver, 1994). К 1995г. в ми-
ре число таких проектов возросло до 100 и более 400 пациен-
тов было непосредственно вовлечено в эти исследования (Hodg-
son, 1995). Подавляющее большинство таких проектов (86) ка-
салось лечения онкологических заболеваний, а также спида.
Таким образом, от опытов на животных и теоретических
построений 80-х годов уже в 1990 году удалось приступить к
реальному лечению моногенных заболеваний, число которых
стремительно нарастает. Естественно, что подобные революци-
онные перемены могли возникнуть только в результате решающих
успехов молекулярной биологии в картировании генов, мутации
которых приводят к наследственным заболеваниям (см.Главу
III), выяснении молекулярной природы этих мутаций (см.Главу
IV), успехов в секвенировании и клонировании генов (см.Главы
I и II), создании генно-инженерных конструкций (см.Главу
II), отработки и совершенствования методов их доставки
(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска-
чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри-
ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря
тому, что предшествующие экспериментальные и клинические
исследования доказали безопасность генной терапии.
Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной
терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова-
ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста-
точно. Следует помнить, что введение в организм человека
последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс-
твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно
предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож-
даться функциональным дисбалансом. Современные представления
о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и
вирусными последовательностями, часто используемыми в ка-
честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать-
ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель-
ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.
Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль-
ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем
лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом
(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении
испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе-
ния дополнительной полезной информации превосходили потенци-
альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с
наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области,
особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс-
ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс-
пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические
испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож-
ны только после ее одобрения соответствующим законодательно
утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив-
ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory
Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам
(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза-
тельным утверждением проекта директором Национального Инсти-
тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;
Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос-
тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев-
ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии
(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли-
нических испытаний должны включать следующие разделы: обос-
нование выбора нозологии для проведения курса генной тера-
пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди-
фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование
биологической безопасности вводимой генной конструкции,
включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс-
генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки
пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку
клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные
последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-
hen-Haguenauer, 1995).
Важнейшим элементом в программе генной терапии является
анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-
дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на
различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-
ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента
и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.
Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в
конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК
в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-
мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии
введенных генов путем идентификации и количественной оценки
соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта
гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ
коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-
лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-
дицинского обследования и вносят необходимые исправления и
добавления в проводимую схему лечения.