Раздел 6.3 Анализ трансляции, днк-экспрессионные систе-

мы.

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и

посттрансляционных модификаций белков основаны на использо-

вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати-

ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-

жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино-

кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга

белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав-

ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез

соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении

меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки

после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова-

ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,

при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,

для значительного числа моногенных наследственных заболева-

ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова-

тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими-

ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного

содержания и отсутствия эффективных методов выделения и

очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от-

носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными

структурами клеток.

ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу-

ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным

средством анализа структуры, функции и синтеза белков

(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно-

ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь-

ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива-

ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень

экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов

инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин-

женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч-

но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,

в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу

рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях

экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге-

нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию

чужеродных белков в клетках.

Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль-

ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и

экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих

систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные

системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким

уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и

их используют, обычно, для производства большого количества

чистого белка, необходимого для получения антител или для

фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-

ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем

сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-

ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-

тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-

мости различных участков белка.

Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-

ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем

в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют

ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-

ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее

использовать для изучения посттрансляционных модификаций

белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-

тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-

ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения

дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-

щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может

быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить

его в кристаллической форме и исследовать пространственную

структуру и функциональное назначение отдельных доменов

(Хэймс, Хиггинс, 1987).

Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-

дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.