- •Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой
- •Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-
- •Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-
- •Глава III
- •Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
- •Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
- •Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
- •Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
- •Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
- •Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
- •Глава X.
- •Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси-
- •Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-
- •Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен-
- •Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-
- •Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг-
- •Глава I
- •Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
- •Глава VI.
- •Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
- •Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
- •Раздел 6.3 Анализ трансляции, днк-экспрессионные систе-
- •Глава II). После секвенирования кДнк можно, исходя из гене-
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Раздел 8.1. Генетические линии животных.
- •Раздел 8.2. Трансгенные животные.
- •Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
- •Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
- •Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
- •Глава iy.
- •Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
- •Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных
- •Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
- •Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-
- •Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
- •Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
- •Глава I. Структура и методы анализа днк.
- •Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
- •Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
- •Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
- •Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
- •Глава VII.
- •Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
- •Раздел 7.2. Днк-диагностика при различных типах насле-
- •Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
- •Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
- •Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
- •Глава IX.
- •Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-
- •Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
- •Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
- •Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
- •Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-
- •Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:
- •Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы
Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
бор клеток-мишеней.
Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе
построения программ генной терапии. Итак, генная терапия
предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише-
ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па-
тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо
для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст-
ранению патологических процессов. В первом случае, в орга-
низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного
гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева-
ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены,
обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству-
ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для
таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ-
фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель-
но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом,
в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге-
нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции
могут служить самые разные соматические клетки, как несущие
дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера-
певтические свойства после трансфекции. В зависимости от
способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те-
рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo),
либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная
терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи-
вирование специфических типов клеток пациента, введение в
них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин-
фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время
большинство допущенных к клиническим испытаниям программ
генной терапии использует именно этот подход (Cul-
ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в
крупных специализированных центрах, требует больших матери-
альных затрат и высоких биотехнологий.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло-
нированных и определенным образом упакованных последователь-
ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые
ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими
их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень
перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко
распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь-
ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен-
но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс-
таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе-
мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как
правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких
как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта-
ми генетической модификации являются специфические типы ле-
гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут
использоваться для модификации различных типов клеток и со
временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и
универсальным способом доставки чужеродного генетического
материала в любые ткани.
Эффективность курса генной терапии в значительной сте-
пени зависит от правильного выбора типов соматических кле-
ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика-
ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного
заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге-
нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю-
бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан-
ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует-
ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы
генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи-
ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер-
вичного биохимического дефекта, исследование структуры,
функции и внутриклеточного распределения его белкового про-
дукта, а также биохимический анализ патологического процес-
са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую-
щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти-
ческих вмешательств определяется также доступностью кле-
ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга-
низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле-
ток, длительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность гене-
тической модификации не самих уже дифференцированных клеток
с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть
долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей
является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых
клеток, которые при создании определенных микроусловий могут
дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки
организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи
предложенный недавно эффективный метод получения стволовых
клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии
наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).
Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене-
тической модификации, завершается оценкой результатов пере-
носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на
животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба-
цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про-
водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного
либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари-
тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных
моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса
экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической
конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет-
ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и
его коррекции на биохимическом уровне.
Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть
решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия-
ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи-
модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор-
ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi-
vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли-
чество синтезированного белка, необходимое для нормализации
биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от-
вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно
быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.
Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую
систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про-
верка надежности работы этой системы может быть осуществлена
только на уровне целого организма. Показатели длительности и
характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут
использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров
для оценки необходимой периодичности повторения терапевти-
ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в
первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже-
родного гена и опасность вирусной контаминации в результате
использования компетентного по репликации вектора (см.ниже),
могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в
программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo
на естественных или искусственно полученных моделях соот-
ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу
VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи-
вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной
терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли-
нических испытаний.