Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-

рапии.

Решающим условием успешной генотерапии является обеспе-

чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком

смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто-

ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель-

ной персистенции его в этих клетках и создание условий для

полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может

проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК,

лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси-

рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями,

белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE -

декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота),

либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли-

шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис-

тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее

встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва-

ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так

называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации

даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной

экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи-

мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие

соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес-

пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного

гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос-

новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя-

ются на химические, физические и биологические. Эффектив-

ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро-

ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в

ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.

Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек-

ции in vitro (Culver, 1994).

--------------------T------------T-------------T------------¬

¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦

¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦

¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦

¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

+-------------------+------------+-------------+------------+

¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦

¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦

¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦

¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦

¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦

¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦

¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦

¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦

¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦

L-------------------+------------+-------------+-------------

Как следует из представленных данных, введение чужерод-

ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-

мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,

бомбардировки частицами золота), так и, практически, при

всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью

рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном

клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-

ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих

необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-

ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-

вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-

на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические

конструкции, включающие вирусные последовательности способны

к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-

прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,

что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-

гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны

на применении ретровирусных векторов.

Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,

Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-

сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)

трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-

кой пакующей способностью (включение генетической конструк-

ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-

интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно

важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-

когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-

тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на

пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).