- •Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой
- •Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-
- •Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-
- •Глава III
- •Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
- •Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
- •Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
- •Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
- •Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
- •Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
- •Глава X.
- •Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси-
- •Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-
- •Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен-
- •Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-
- •Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг-
- •Глава I
- •Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
- •Глава VI.
- •Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
- •Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
- •Раздел 6.3 Анализ трансляции, днк-экспрессионные систе-
- •Глава II). После секвенирования кДнк можно, исходя из гене-
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Глава II.
- •Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
- •Раздел 2.2. Повторяющиеся последовательности днк.
- •Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
- •Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
- •Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
- •Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные днк.
- •Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
- •Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
- •Раздел 8.1. Генетические линии животных.
- •Раздел 8.2. Трансгенные животные.
- •Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
- •Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
- •Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
- •Глава iy.
- •Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
- •Раздел 4.2. Генетическая гетерогенность наследственных
- •Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
- •Раздел 4.4. Идентификация структурных мутаций, изоляция му-
- •Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
- •Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
- •Глава I. Структура и методы анализа днк.
- •Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
- •Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
- •Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
- •Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
- •Глава VII.
- •Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
- •Раздел 7.2. Днк-диагностика при различных типах насле-
- •Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
- •Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
- •Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
- •Глава IX.
- •Раздел 9.1 Определение, историческая справка, програм-
- •Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
- •Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
- •Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
- •Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-
- •Раздел 9.6. Генотерапия ненаследственных заболеваний:
- •Раздел 9.7. Некоторые этические и социальные проблемы
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
сайты.
Перечисленные выше компоненты генома не случайным обра-
зом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом
смысле можно говорить о существовании в геноме человека
структур более высокого иерархического порядка. Примером
служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты
ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.
62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано
около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохора-
ми, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных
GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), нахо-
дится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,
1993). Таким образом, существуют относительно небольшие
участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше,
чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in
vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК
метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицити-
дина. Экспериментальное изучение характера метилирования
основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образую-
щихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты
узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но
действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того,
находится ли это основание в метилированном состоянии или
нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают после-
довательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепля-
ет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метили-
рован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к
повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в
местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' -
сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается
характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3'
последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные
индивидуумы, независимо от их этнического происхождения,
практически не различаются по характеру метилирования ДНК в
одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене-
тической дифференцировки происходят значительные изменения
рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу-
холевого происхождения число метилированных сайтов резко
уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между
метилированием ДНК и состоянием генетической активности в
клетках. Существует класс белков, которые специфическим об-
разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их
недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз-
можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен-
тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации
эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив-
ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области
генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде-
тельствует о функциональной активности генов. Показано, что
необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-
ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-
лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-
мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а
также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-
номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности
некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть
прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-
ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-
рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-
ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,
родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных
факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов
узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих
неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-
ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-
пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-
ляются характерной особенностью транскрибируемых участков
генома. Их идентификация в клонированных последовательностях
геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных
структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG
островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-
ные методы регистрации СрG островков показали, что их число
в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека
сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-
но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-
ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-
димому, это необходимое, но не достаточное условие их
экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-
няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-
торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-
ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-
тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-
ях это области функционально активных генов, находящихся в
деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-
тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод
ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-
мосомных препаратах визуализировать функционально активные
районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-
тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-
мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-
ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно
только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-
тивные гены (Verma, Babu, 1989).