Распределение микроорганизмов в перегнойно-глеевой и дерново-подзолистой почве по частицам разной величины (число адгезированных клеток)

Диаметр частиц, мкм	Величина поверхности, мкм2	Перегнойно- глеевая почва	Дерново- подзолнстая почва
1-2	13	1	0,1
4-5	121	4	0,3
10-12	726	8	1,1
20-25	2 905	29	5,0
40-50	12 150	110	7,0
100-110	66 150	300	14,0
400-500	1 215 000	10 100	53,0

80-90% клеток в почве обычно находится в адгезированном со­стоянии. Много свободно плавающих клеток появляется в поч­венном растворе только после внесения в почву легкораствори­мых питательных веществ (сахара, органические кислоты), хотя каждый микроорганизм, по-видимому, имеет прикрепленную ста­дию, обычно предназначенную для жизнедеятельности или для сохранения, и свободную стадию, предназначенную для расселе­ния. Адгезия микроорганизмов зависит от 1) особенностей мик­роорганизма, 2) особенностей адсорбента, 3) состава жидкой сре­ды, в которой она осуществляется: рН, концентрации и природы катионов и других веществ. В первом приближении можно гово­рить о прямо пропорциональной зависимости количества адге­зированных клеток от величины поверхности почвенных частиц (табл. 2), хотя более подробное изучение показывает, что бакте­рии располагаются на отдельных частицах крайне неравномерно. Некоторые частицы несут очень много клеток, другие частицы того же размера почти лишены их, что обусловлено различиями в химическом составе поверхности частиц.

ПРИРОДА ЯВЛЕНИЯ АДГЕЗИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Адгезия микроорганизмов представляется важной экологиче­ской чертой существования микроорганизмов. Она экологиче­ски оправдана, и без адгезии микробы не могли бы нормально существовать в почве: во-первых, адгезия помогает микробам удер­жаться в почвенном профиле и не подвергаться вымыванию в нижележащие горизонты; во-вторых, адгезированные клетки ока­зываются на границе раздела твердого тела и жидкости, где со­средоточены основные питательные вещества. Адгезия имеет и более целенаправленное значение. Так, бактерии, использующие целлюлозу, преимущественно адгезируются на целлюлозе, исполь­зующие крахмал — на крахмале, окисляющие серу — на ее крис­таллах или каплях. Микробы, утилизирующие углеводороды, также избирательно адгезируются на них, а клубеньковые бактерии и фитопатогенные микроорганизмы избирательно адгезируются на корнях растений-хозяев. Обычно микроорганизмы по-разному адгезируются на разных стадиях своего развития. Есть стадии, на которых они находятся в свободном состоянии, и есть стадии, на которых они ведут прикрепленный образ жизни. Некоторые мик­робы переходят в адгезированное состояние в стадиях покоя, другие, наоборот, в активном состоянии адгезируются, а в ста­диях покоя могут находиться в свободном состоянии.

С помощью каких же механизмов достигается такая тонкая регулировка процессов прикрепления и отрыва?

В настоящее время существует гипотеза, что микроорганизмы могут очень тонко и точно регулировать свое положение (сво­бодное или адгезированное), для чего у них имеется ряд генети­чески запрограммированных особенностей. Это возможность синтеза определенных ферментов, изменения заряда и степени гидрофобное™ своей поверхности, синтез поверхностно-актив­ных веществ, образование выростов, деление, хемотаксис и др. Микробы экологически целесообразно могут менять свое поло­жение, располагаясь в свободном или адгезированном положе­нии в зависимости от того, что в данный момент экологически выгодно.

Существовало несколько подходов к изучению природы адге­зии микроорганизмов. Многие исследователи, изучавшие это явление до 70-х годов XX в., пытались проводить аналогию меж­ду адгезией микроорганизмов и адсорбцией ионов и молекул. Именно тогда широко употреблялся термин «адсорбция микро­организмов». Пытались установить, в чем сходство и в чем раз­личие в адсорбции микробных клеток и молекул, строили изо­термы адсорбции, определяли влияние рН и концентрации катионов, устанавливали емкость поглощения, обменность ад­сорбции макроорганизмов и др. Обменная адсорбция изучалась с двух разных позиций: с одной стороны, устанавливалась воз­можность обмена одних микробных клеток на другие, с другой — изучалась возможность замены клеток на ионы. «Адсорбцион­ное» направление продолжает развиваться и в настоящее время, но теперь имеет подчиненное значение. Это направление иссле­дований было плодотворно, так как был установлен ряд пенных закономерностей адсорбции микробных клеток. Однако такой подход не мог разрешить все вопросы.

Некоторые исследователи изучали явление концентрации кле­ток на твердых поверхностях с позиций адгезионных процессов. Адгезией называется слипание поверхностей двух разнородных твердых тел. Адгезия обусловлена теми же причинами, что и ад­сорбция, но проявления этого процесса несколько другие, по­скольку взаимодействуют не молекулы или ионы, а более круп­ные частицы. С теоретических позиций такой подход является более правильным, и в последнее время почти все исследователи пользуются термином «адгезия микроорганизмов», а не «адсорб­ция микроорганизмов». Это направление успешно развивается, что позволит уточнить ряд закономерностей.

В последнее время были введены еше один подход и еще один термин для обозначения того же явления — «иммобилизация кле­ток» (обездвиживание клеток). Представление об иммобилизо­ванных клетках пришло из биохимии, где усиленно изучают им­мобилизованные ферменты. Во многих случаях изучена природа связи ферментов с адсорбентом и специфика их активности. Поскольку было выяснено, что в ряде случаев для проведения определенных биохимических процессов, особенно многоступен­чатых, часто выгоднее и удобнее использовать не отдельные фер­менты, а их комплексы, локализованные в целых живых или уби­тых клетках микроорганизмов, то от изучения иммобилизованных ферментов перешли к изучению иммобилизованных клеток. Под иммобилизованными понимают либо клетки, адгезированные на твердых поверхностях самых различных частиц (пористое стек­ло, полимерные частицы, керамика, полимеры и др.), либо клет­ки, заключенные в различные гели. Последний случай часто ис­пользуется и он хорошо изучен. Следует отметить, что оба случая имеют прямое отношение к почвенным микроорганизмам, по­скольку в почве микробы также либо адгезированы на почвен­ных частицах, либо заключены в органоминеральный гель, по­крывающий почвенные частицы. Интересно отметить, что часто клетки, заключенные в прочные сети геля, не могут размножать­ся. При изучении иммобилизованных клеток были использова­ны методы и достижения биохимии и молекулярной биологии. Однако природа сил, связывающих клетки, изучена гораздо хуже, чем природа сил, связывающих ферменты. Часто биохимики создают условия, которые могут быть аналогичны природным, но в ряде случаев создаются и чисто искусственные условия.

Наконец, четвертый подход, который стал очень популяр­ным в последнее десятилетие и был особенно широко исполь­зован в медицинской микробиологии, — это молекулярно-био- логический подход, подобный тому, который используется в иммунохимии.

Внимание к вопросу об адгезии микроорганизмов было при­влечено в связи с тем, что адгезия является первым этапом мно­гих инфекционных болезней, и если предотвратить адгезию, то можно предотвратить и возникновение заболевания. Полагают, что адгезия клеток микроорганизмов основывается на специфи­ческом механизме и происходит по принципу взаимодействия антигена с антителом — поверхность клетки подходит к адсорби­рующей поверхности, как ключ к замку. Особенные успехи дос­тигнуты в изучении адгезии клеток микроорганизмов на живот­ных и растительных клетках.

Исследуя адгезию микроорганизмов, первые исследователи особенно большое значение придавали электрическому заряду взаимодействующих поверхностей и считали, что происходит взаи­модействие противоположно заряженных поверхностей. Счита­ли, что происходит взаимодействие разноименно заряженных поверхностей. Это явление наблюдали при адгезии клеток на оксидах железа и алюминия при низких значениях рН, а также при адгезии на ионообменных смолах (анионитах).

Однако в большинстве случаев при адгезии клеток происхо­дит взаимодействие поверхностей с одноименным отрицатель­ным суммарным зарядом. Прежде всего это взаимодействие с большинством почвенных частиц, с минералами и гумусом. При этом микроорганизмы несут на поверхности преимущественно карбоксильные и аминогруппы, отчасти фосфорные, сульфгид- рильные, спиртовые и др. Минералы в основном имеют ОН-груп- пы, гумус — карбоксильные группы. В ряде случаев адгезия объяс­нялась мозаичностью зарядов поверхности клеток и поверхности адсорбента. Австралийский ученый К. Маршалл, изучавший ад­гезию мелких частиц монтмориллонита (0,1 мкм) на клетках клу­беньковых бактерий, пришел к выводу, что в опытах имело мес­то электростатическое притяжение положительно заряженных концов пластинчатых частиц глины и отрицательно заряженных карбоксильных групп поверхности клетки. Для некоторых штам­мов клубеньковых бактерий происходило взаимодействие поло­жительно заряженных участков клетки, несущих аминогруппы, с отрицательно заряженными боковыми плоскостями частиц монт­мориллонита.

При взаимодействии двух отрицательно заряженных поверхно­стей на установление контакта влияют силы отталкивания одно­именно отрицательно заряженных поверхностей, которые могут быть учтены по теории Дебая-Гюккеля. Силы отталкивания умень­шаются с расстоянием по экспоненциальному закону (рис. 92). Кроме сил отталкивания между поверхностями контактирующих клеток и частиц адсорбента будут действовать и физические силы притяжения, обусловленные квантово-механическими эффекта­ми взаимодействия электронных осцилляторов (силы Ван-дер- Ваальса — дисперсионные, индукционные, ориентационные). Силы Ван-дер-Ваальса уменьшаются с увеличением расстояния по сте­пенному закону. Б.В. Дерягин и Л.Д.Ландау в конце 30-х годов XX в. объяснили многие особенности поведения коллоидных сис­тем (флокуляция, зависимость устойчивости от состава среды) сложением электростатических сил отталкивания и ван-дер-вааль- совых сил притяжения. На основании этой идеи построена теория стабильности коллоидных систем, названная ДЛВО (Дерягин-Лан- дау-Вервей-Овербик), по начальным буквам фамилий ее создате­лей. Она широко используется в биологии, в частности для объяс­нения адгезии микроорганизмов.

Рис. 92. Зависимость свободной энергии от удаления от частицы как функция концентрации электролита при сближении одноименно заря­женных поверхностей:

а — низкая концентрация; б — средняя концентрация; в — высокая концентрация; h — рас­стояние от поверхности; Gj — свободная энергия; Ga — свободная энергия сил Ван-дер- Ваапьса; Ge— энергия, связанная с присутствием на поверхности заряженных групп

Взаимодействие рассматриваемых сил приводит к существо­ванию двух областей, в которых преобладают силы притяжения. Одна область расположена от поверхности на расстоянии 5-10 А. Прочность сцепления в этой области большая. На больших рас­стояниях начинают преобладать силы отталкивания, и затем на расстоянии около 100-150 А от поверхности имеется вторая об­ласть притяжения, однако прочность сцепления в этой области невелика.

Для того чтобы поверхности сблизились до расстояния 5-10 А, они должны преодолеть электростатическое отталкивание. Силы отталкивания между поверхностями снижаются при введении катионов, особенно многовалентных, или при подкислении сре­ды. Они пропорциональны радиусу взаимодействующих поверх­ностей. Видимо, поэтому палочковидные клетки, по крайней мере на первых этапах, прикрепляются полюсом. Большинство мик­роорганизмов прикрепляется с помощью тонких нитей — фимб- рий, стебельков, выростов капсул и др.

Точные определения расстояния между клетками и поверхно­стью проводить довольно трудно. Однако есть основания пола­гать, что клетки могут располагаться на расстоянии первого и второго максимумов притяжения, а также может устанавливать­ся химическая связь между клеткой и поверхностью. Наблюде­ния, проведенные под микроскопом, показали, что клетки часто свободно скользят вдоль поверхности, но не могут отойти от нее, т.е. находятся на расстоянии 100-150 А. После высушивания пре­парата и последующей его регидратации клетки оказываются прочно закрепленными на определенных местах и их не удается смыть даже сильной струей воды. Вероятно, здесь проявилось прикрепление во втором максимуме притяжения или образова­ние химических связей. Отметим, что для прочного прикрепле­ния высушивание необязательно. Иногда клетки очень прочно прикрепляются и из водной среды.

Микроорганизмы по своим размерам (1-10 мкм) относятся к той категории частиц, которые должны быть подвержены наибо­лее сильной адгезии. У частиц большего размера гравитацион­ные силы превосходят силы прилипания, частицы меньшего раз­мера из-за малого веса не в состоянии выдавить слой жидкости и вступить в непосредственный контакт с поверхностью.

Некоторые исследователи утверждают, что главную роль в ад­гезии клеток микроорганизмов играют силы Ван-дер-Ваальса. Однако в ряде случаев прочность связи оказывается гораздо боль­ше, чем можно было бы ожидать за счет этих сил.

При адгезии действует сложный комплекс сил. Силы притя­жения.

1. Химические связи между взаимодействующими поверхнос­тями, например, водородные, тиоловые, амидные, эфирные и др.

2. Образование ионных пар и ионных триплетов, например NH₃...-OOC- и -СОО-...Са...-ООС- Этот тип связей включает энергию десольватации.

3. Силы, вызванные флуктуацией зарядов взаимодействую­щих тел.

4. Мозаичный заряд на поверхностях подобного или противо­положного общего заряда, специфически возникающий из электростатического притяжения геометрически упорядоченных зарядов.

5. Силы, обусловленные притягательным взаимодействием противоположно заряженных тел.

6. Электростатическое притяжение между поверхностями, не­сущими одинаковый заряд.

7. Электростатическое притяжение, обусловленное отражен­ными силами, которые можно рассматривать как обусловлен­ные десольватацией внутримембранных ионов при объедине­нии мембран.

8. Силы Ван-дер-Ваальса.

9. Гидрофобные взаимодействия.

Помимо сил притяжения при адгезии клеток могут действо­вать силы отталкивания.

10. Силы отталкивания одноименно заряженных поверхностей.

11. Препятствия притяжению, обусловленные пространст­венными барьерами, такими как сольватные слои.

Таким образом, комбинация сил, действующих при адгезии, представляется довольно сложной, расчет и предсказание вели­чины этих сил практически невозможны.

Очень долго изучали адгезию клеток на чистых минеральных поверхностях и только в последнее время пришли к выводу, что в подавляющем большинстве случаев взаимодействие происходит между макромолекулами поверхности клеток и макромолекулами или более простыми органическими молекулами, такими как ли- ииды, поверхностно-активные вещества и др., адсорбированны­ми на минеральной поверхности почвенных частиц. Таким обра­зом, вопрос об адгезии сводится к проблеме взаимодействия макромолекул, которое очень разнообразно.

После того как проблема изучалась с физико-химических по­зиций, она, как видно, в некоторых отношениях зашла в тупик.

В последнее время ее пытаются решить с позиций молекулярной биологии.

Молекулярно-биологические аспекты адгезии микроорганиз­мов на почвенных частицах представляют интригующую область, которая только начинает развиваться в основном в медицинской микробиологии при установлении взаимодействия бактерий с поверхностью клеток животных тканей. Микробы адгезируются на поверхности различных органов и тканей, причем адгезия идет специфично и избирательно. Микрофлора языка, щек, нёба, зу­бов, разных отделов кишечного тракта различна, т.е. специфич­на для каждого органа. Наиболее подробно изучена адгезия хо­лерного вибриона, гонококка, патогенных штаммов кишечной палочки и микробов, вызывающих кариес зубов.

Адгезия бактерий включает в себя несколько этапов. Первый этап состоит в целенаправленном движении бактерий к адсорби­рующей поверхности. Он возможен для подвижных микроорга­низмов и осуществляется благодаря наличию хемотаксиса. Хе­мотаксис у бактерий в настоящее время хорошо изучен и осуществляется по градиенту концентрации какого-либо веще­ства. Подробно исследован хемотаксис в градиенте концентра­ций Сахаров и аминокислот.

Предполагается, что во всех случаях прикрепление осуществ­ляется за счет специфического субстрат-ферментного взаимодей­ствия. В ряде случаев адгезия проходит за счет специфического химического взаимодействия адгезина и акцептора, причем уста­новлены конкретные химические группировки, ответственные за адгезию. Более подробно это изучено для адгезии патогенных бактерий на эпителии кишечного тракта, но относится также к адгезии фитопатогенов и симбиотических клубеньковых бакте­рий на корнях бобовых растений.

Для животных и человека установлено, что микробы адгези­руются на поверхности различных органов и тканей, причем ад­гезия идет специфично и избирательно. Подобное явление наблю­дается и для растений, и почвенных беспозвоночных животных. Адгезия бактерий включает в себя несколько этапов. Первый этап состоит в целенаправленном движении бактерий к адсорбирую­щей поверхности. Он возможен для подвижных микроорганизмов и осуществляется благодаря наличию хемотаксиса. У бактерий хемотаксис в настоящее время хорошо изучен и осуществляется по градиенту концентрации какого-либо вещества. Подробно исследован хемотаксис в градиенте концентраций Сахаров и

аминокислот. Приблизившись к поверхности, бактерии взаи­модействуют с ней сначала с помощью достаточно слабых водо­родных и гидрофобных взаимодействий, а также сил Ван-дер- Ваальса согласно теории Дерягина-Ландау-Вервея-Овербика (ДЛВО) (рис.92), которые, однако, не могут обеспечить боль­шой специфичности взаимодействия. При этом молекула адге- зина — полимера, расположенного на поверхности бактерий, вза­имодействует с рецептором — полимером, расположенным на поверхности адсорбента (рис. 93). Взаимодействие адгезина с ре­цептором осуществляется по тому же механизму, что и взаимо­действие антигена с антителом (ключ-замок). Затем часто насту­пает более прочное прикрепление, которое требует времени и осуществляется только через несколько часов или даже суток после начала адгезии и достигается благодаря синтезу бактериями био­полимера, обычно полисахаридов, но иногда и полипептидов, с помощью которых клетки прикрепляются иногда так прочно, что легче разрушить клетку, чем отделить ее от адсорбента. Экспери­ментально показано, что именно так прочно прикреплены мно­гие собственно почвенные бактерии.

♦ • • • •

в #3

Л

Бактериальные адгезины могут быть протеинами, липидной частью липотейхоевой кислоты, сахарами и другими углеводами. Насколько пока известно, рецепторами на эпителиальных клетках

I 4 fl 5

«> V. «у t Ч ч t г 'г' xj

Рис. 93. Взаимодействие бактерий с поверхностью животных клеток по принципу ключ-замок:

1 — молекула специфических адгезинов; 2 — О комплементарные или рецепторные молеку­

лы; 3 — протеины: 4 — гидрофобные молекулы; 5— фосфолипиды; а — адгезия осуществи­лась; 6, в — адгезия не наступила из-за введения избыточною количества рецептора или

адгезина

животных и человека являются почти исключительно углеводы: манноза, галактоза, фукоза, а также сиаловая кислота.

КЛЕТКА

йТйй

гп

Адгезии

ЧАСТИЦА

Адгезия почвенных бакте­рий для некоторых из них мо­жет быть весьма избиратель­ной и зависит от характера ад­сорбирующей поверхности. Правда, в других случаях она не зависит от характера по­верхности. Последним свойст­вом отличаются истинно пе- рифитонные (прикрепляющие­ся) микроорганизмы. Адгезия может быть объяснена нали­чием у них нескольких разных типов адгезинов (рис. 94).

Рис. 94. Взаимодействие клеток бактерий с гидрофильной (/) и гидрофобной (2) поверхностями

Таким образом, адгезия генетически запрограммирована, имеет важное экологическое значение и во многих случаях определяет выживание вида.

ДЕСОРБЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ИХ КОЛИЧЕСТВЕННОМ УЧЕТЕ В ПОЧВЕ

Для правильного количественного учета микроорганизмов в почвах необходимо вызвать три процесса: 1) разрушить почвен­ные агрегаты, 2) десорбировать почвенные микроорганизмы с твердых поверхностей, 3) разделить находящиеся в почве микро­колонии на отдельные составляющие их клетки. Все три процес­са вызываются одинаковыми воздействиями, хотя очень трудно осуществить их полностью. Типы воздействия могут быть меха­ническими и химическими. Механические воздействия — это растирание, обработка почвенной суспензии на пропеллерной мешалке (миксер, микроизмельчитель тканей, магнитная мешалка),

ультразвуковая (УЗ) обработка. Химические воздействия — это обработка щелочью или раствором пирофосфата натрия, кото­рый обладает щелочным действием, воздействие поверхностно- активными веществами (ПАВ), например додецилсульфатом нат­рия, обработка ферментами.

Наиболее эффективными оказались механические обработ­ки. Для учета бактерий методом посева или прямым микроско­пическим методом используют УЗ небольшой частоты и мощ­ности, так как в противном случае будут разрушены сами клетки. Собственно почвенные бактерии гораздо более устойчивы к УЗ, чем их лабораторные культуры. Существует такая закономер­ность: чем крупнее клетки, тем больше они разрушаются УЗ. Поэтому для грибов, как более крупных организмов УЗ доволь­но губителен и при учете грибов лучше применять пропеллер-' ную мешалку, добиваясь разрушения почвенных агрегатов и дробления мицелия на однородные части длиной 15-30 мкм при сохранении ими жизнеспособности и целостности конидий и половых спор.

Если количественный учет микроорганизмов в почве прово­дится без тщательной предварительной подготовки почвенной суспензии, получают совершенно неверные результаты. Предва­рительная обработка почвенной суспензии повышает определяе­мое количество микроорганизмов в зависимости от типа и состо­яния почвы в 3-300 раз. Особенно сильный эффект получается для сухих оструктуренных почв. Малый эффект наблюдается для сильно увлажненных нижних минеральных горизонтов почв. При традиционном способе подготовки почвенной суспензии путем 10-минутного перемешивания почвенной суспензии в колбе мож­но получить, хотя и не абсолютные, но годные для сравнения результаты, например, для разных делянок одной и той же почвы одинаково увлажненных, но содержащих разные количества удоб­рений. Такое сравнение невозможно для почв разных типов или почвенных образцов из разных генетических горизонтов, а также для сравнения сухих и увлажненных почв. Часто делают вывод о том, что при высушивании почв клетки погибают, а они по край­ней мере частично переходят в адсорбированное состояние и не учитываются.

Если старый метод давал различие в содержании бактерий в разных типах почв в 2-3 раза, то с применением новых методов диспергирования почв и десорбции микроорганизмов оказалось, что эти различия достигают десятков и даже сотен раз.

АКТИВНОСТЬ АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК

Адгезированные клетки находятся в специфической микрозо­не, образующейся на границе раздела жидкости и твердого тела, где адсорбируется большинство полимерных органических ве­ществ в том числе и гумус, происходит адсорбция гидролити­ческих ферментов. Поскольку большинство почвенных частиц заряжены отрицательно, здесь концентрируются положительно заряженные органические мономеры, повышается концентрация адсорбированных катионов (К, NH₄ Са, Mg, Н), уменьшается концентрация неорганических и органических анионов (рис. 95). Активность адгезированных клеток по сравнению со свободны­ми часто резко изменяется. Она может быть больше или меньше, чем у свободных в за­висимости от того,

Рис. 95. Концентрирова­ние клеток бактерий (Г), катионов (2), субстратов (3), экзоферментов и других биологически ак­тивных веществ (4) на поверхности почвенных частиц

1 •2 А 3 ■ 4

окажутся ли условия в микрозоне на поверхности раздела более или менее благоприятными, чем в почвенном растворе. Обычно эта микрозона более благоприятная, так как адсорбированные гидролазы осуществляют гидролиз полимеров и появляются лег­кодоступные мономеры (сахара, аминокислоты, органические кислоты, спирты). Микробы лучше обеспечены минеральными питательными веществами в том числе фосфором и железом, которые также осаждаются на поверхности частиц. Автотроф- ные нитрификаторы используют преимущественно адсорбиро­ванный аммоний.

Однако на поверхности раздела жидкой и твердой фаз могут концентрироваться и токсичные вещества, такие как тяжелые металлы, антибиотики. Здесь может быть меньше отрицательно заряженных органических кислот или аминокислот и тогда адге­зированные микробы будут развиваться хуже. На поверхности раздела отрицательно заряженных частиц в кислых почвах будет

более низкое рН из-за высокой концентрации ионов водоро­да, что также будет оказывать влияние на развитие микробов. Почвенные биохимики предложили молекулярный рН-метр для

Активность катаяазы мл 0мии

18

1Б

14

12

8 9 рН раствора

Рис. 96. Кажущийся сдвиг рН оптимума каталазы при ее адсорбции на частицах минерала

шиттшттп*

t)

ТГ

измерения рН на поверхности твердых частиц. На поверхности частицы адсор­бируют фермент и затем определяют оптимальное рН для проявления его максимальной активности (рис. 96). Это осуществляется следующим обра­зом. Находят оптимум рН действия фермента для двух растворов. В одном растворе фермент находится в свобод­ном, в другом — в адсорбированном состоянии. Для адсорбированного фер- ■ мента наблюдается «кажущийся» сдвиг в щелочную область. Он может дости­гать единицы рН и более. В действи­тельности никакого сдвига рН-опти- мума для адсорбированного фермента не происходит. Просто он находится в зоне с более низкими значениями рН. Доказано, что в этой зоне происходит изменение и концентрации, и активности ионов водорода. С помощью ферментов можно определять рН в микрозонах. Из­менение рН на поверхности влияет не только на активность фермента, но и на активность адгезированных клеток. Фермен­ты могут адсорбироваться различным об­разом (рис. 97). Фермент представляет собой белковую глобулу с активным цен­тром, к которому подходит субстрат. Глобула имеет положительно и отрица-

1

Рис. 97. Адсорбция фермента (белые круги) и субстрата (черные круги) на поверхности ми­нерала в слое органоминерального геля и в межплоскостном пространстве монтморил­лонита

тельно заряженные, гидрофильные и гидрофобные участки. Поэтому на разных почвенных частицах адсорбция проходит раз­ными сторонами. Если закрывается активный центр, фермент

теряет активность. Обычно при адсорбции изменяется конфор- мация (конфигурация) молекулы, что ведет к изменению актив­ности фермента, но он становится более устойчивым к воздей­ствию неблагоприятных факторов (высушивание, хранение, температурные воздействия и др.). Фермент может быть закрыт органоминеральным гелем или может попасть в межплоскост­ные пространства минералов типа монтмориллонита. Все это будет отражаться на его активности. Молекула субстрата может быть очень маленькой (Н₂0₂) или очень крупной, например, белковая молекула для протеазы (на рисунке обозначена чер­ными кружками).

Адсорбированные (иммобилизованные) ферменты в последние 30 лет широко применяются в биотехнологии. Однако, как обна­ружилось, природа использует эти механизмы уже миллиарды лет.

В настоящее время хорошо изучено влияние адсорбентов на различные типы брожений, на азотфиксацию, нитрификацию, использование кислых и основных аминокислот, окисление мета­на, водорода, использование некоторых углеводородов. Наиболее сильно влияние твердых частиц проявляется в разбавленных раст­ворах, каковым, в частности, обычно является почвенный раст­вор. Здесь микроорганизмы часто не могут развиваться в растворе из-за низкой концентрации питательных веществ, но на поверх­ности частиц они развиваются, так как здесь концентрация пита­ния оказывается гораздо больше. Это явление было подробно изу­чено водными микробиологами для олиготрофных водоемов (см. рис. 95). Влияние адсорбента может оказывать различный и даже прямо противоположный эффект в зависимости от взаимного рас­положения частиц адсорбента и клеток (рис. 98). В случае а на клетки будет оказывать влияние специфика поверхности раздела

Рис. 98. Различные случаи взаимного расположения частиц адсорбентов и клеток бактерий (объяснения см. в тексте)

а

б

в г

жидкости и твердого тела. В случае 6 адсорбент не будет оказы­вать непосредственного действия на клетки. В случае в клетки покрываются чехлом из коллоидных частиц гумуса или глинистых

Рис. 100. Отрыв эпителиальных клеток с адгезированными мик­робами от поверхности расти­тельной ткани

минералов и их окру-

Рис. 99. Степень уда­ленности адгезирован- ных клеток от твердой поверхности минераль­ной частицы и покры­вающего ее органоми- нерального геля

жение, влияющее на жизнедеятельность, будет особым. Четвер­тый случай г представляет собой заключение клеток внутри конг­ломерата из частиц. Часто актив­ность клеток в таких условиях вообще невозможна.

Активность будет зависеть от плотности контакта с частицами (рис.99). Показано 10случаев бо­лее или менее плотного контакта клетки бактерии с почвенной час­тицей, покрытой пленкой из орга­нического или минерального геля: от полного удаления от частицы до расположения на поверхности геля, внутри геля или на поверхности минеральной частицы. Поверх­ность минеральной частицы пока­зана на рисунке черной линией, а органоминеральный слой окрашен в серый цвет. Клетки со стебель­ком, жгутиками, фимбриями, с капсулой или без нее будут распо­лагаться в разных по свойствам микрозонах. Особое положение занимают клетки, погруженные в органоминеральный гель (собст­венно иммобилизованные клетки). Во многих случаях они во­обще не могут делиться. Ясно, что в каждом случае микросреда

для развития клетки будет разной, а клетка всегда развивается в микросреде.

Эффективный способ борьбы с прикрепившимися фитопато- генными микроорганизмами имеется у растительных и живот­ных организмов. Если клетки прикрепились и нет возможности от них избавиться, корень или другой орган растения или живот­ного сбрасывает клетки своего эпителия и таким образом осво­бождается от вредных микроорганизмов (рис. 100).

Жидкая фаза почвы

'///////////////У///////////,

^7777777^}

7777777777777777777777777777

7777777^77^^

Жидкая фаза почвы (почвенный раствор) обычно располага­ется в капиллярах или образует пленки разной толщины. Капил­ляры и пленки могут быть значительно толще или тоньше клеток микроорганизмов (рис. 101). Сравнительно редко после дождей, полива или подъема уровня фунтовых вод в почве появляются большие объемы воды, которые движутся под действием сил гравита­ции. Для жидкой фазы почвы характерна мик­розональность в отноше­нии содержания газов, органических веществ, рН, Eh и др. На протяже­нии некоторого времени микрозоны могут разли­

чие. 101. Пространственное расположение клеток бакте­рий (Г) и различных форм воды (2)

чаться и по потенциалу влаги. Он может быть различным в тече­ние долгого времени в разных почвенных горизонтах.

Жидкая фаза почвы всегда содержит некоторое количество минеральных, органических и органоминеральных веществ в молекулярном или коллоидном состоянии, а также растворен­ные газы. Однако концентрация питательных веществ в почвен­ном растворе обычно очень мала, и развитие микроорганизмов в объеме почвенного раствора происходит сравнительно редко. Они

развиваются в адгезированном состоянии. Таким образом, глав­ная функция почвенного раствора заключается в переносе ве­ществ и обеспечении микроорганизмов водой. Снабжение пита­тельными веществами обычно проходит два этапа: 1) перенос питательных веществ с почвенным раствором на твердую поверх­ность и концентрирование на ней, 2) использование адсорбиро­ванных веществ адгезированными микробными клетками.

Почвенный раствор в сотни и тысячи раз менее концентриро­ван по сравнению с обычно применяемыми микробиологическими питательными средами, например средой Чапека, мясо-пептон- ным бульоном или крахмало-аммиачной средой. Отсюда возник­ла идея о необходимости применения при культивировании поч­венных микроорганизмов очень разбавленных питательных сред, особенно в тех случаях, когда исследователь хочет приблизиться к воссозданию естественной обстановки. В этих условиях удает­ся выделять и изучать олиготрофы. Микроорганизмы успешно развиваются в разбавленных питательных растворах и здесь их вырастает гораздо больше, чем на богатых средах. Так, на разбав­ленном в 10 раз мясо-пептонном агаре вырастает в 5-10 раз больше колоний, чем на исходном, на агаризованной воде — еще боль­ше, но их уже нужно подсчитывать через месяц, а не через три дня, как на МПА и рассматривать в бинокулярную лупу, так как колонии очень малы. Трудность изучения состоит в том, что они растут очень медленно и экспериментатор должен затратить дли­тельное время. Необходимо также иметь в виду, что в отдельных микрозонах и в естественной почве могут создаваться высокие концентрации растворенных и нерастворенных органических питательных веществ. Примером микрозон первого типа может служить ризоплана с непрерывным поступлением большого ко­личества корневых выделений, а примером микрозон второго типа— отмерший корешок растения или погибший дождевой червь.

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ ПОЧВЕННОЙ ВЛАГИ (ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ, АКТИВНОСТЬ ВОДЫ)

Условия увлажнения в почве обычно характеризовали ее влаж­ностью, выраженной в процентах от веса. Однако эта величина недостаточно точно определяет степень доступности воды для организмов. Например, при 20%-й влажности глинистой и пес­чаной почв степень доступности воды для организмов различ­ная. В глинистой почве она меньше, так как вода будет связана с огромной поверхностью глинистых частиц, а в песчаной — больше. Возможность объективно оценить состояние воды в поч­ве и ее влияние на жизнедеятельность микроорганизмов дает определение потенциала влаги (активности воды), так как в этом случае состояние воды в почве, растениях, микроорганизмах, ат­мосфере, снегу и во льду характеризуется при помощи единой, физически строго определенной величины — термодинамиче­ского потенциала. Этот показатель характеризует степень свя­занности и термодинамической подвижности воды в системе, причем он не зависит от того, связана ли вода с поверхностью почвенных частиц, ионов солей, макромолекул или кристаллов льда.

В микробиологии наиболее часто используется термин актив­ность воды (a_w), который характеризует степень связанности ее молекул и тем самым степень доступности для микроорганиз­мов. Активность воды соответствует проценту относительной влажности воздуха, о которой ежедневно сообщается в сводках погоды. Только эта величина выражена не в процентах, а в долях единицы. Активность свободной воды равна единице. При взаи­модействии воды с твердыми поверхностями, катионами и анио­нами, молекулами мономеров и полимеров, т.е. любыми гидро­фильными группировками, активность воды становится меньше единицы. Активность воды определяется по формуле

^ Р __ ов _ п₂

°^w P_Q 100 /7, - П₂ '

где Р— давление водяного пара в исследуемой системе, Р₀ — дав­ление пара над чистой водой, ОВ — относительная влажность воздуха в системе, Я, — число молей растворителя, П₂ — число молей растворенного вещества.

Состояние воды в системе часто определяется потенциалом влаги. Он характеризуется давлением, которое нужно приложить, чтобы при данных условиях началось удаление молекул воды из системы. Иначе можно сказать, что потенциал влаги измеряется количеством работы, которая должна быть затрачена для извле­чения воды:

_p=d± dV'

где А — работа, V— объем.

Потенциал чистой воды равен нулю. По отношению к чистой воде все растворы имеют отрицательные потенциалы, которые выражаются в отрицательных атмосферах или мегапаскалях (МПа) (1 атм = О,I МПа).

Сопоставление различных величин, выражающих термодина­мическое состояние воды, представлено в табл. 3.

Водный потенциал часто выражается в барах (1 бар= 10⁶дин/см² = = 0,987 атм). Его также можно выразить через активность воды (табл. 3).

Таблица 3