Раздел 3

Поскольку обычно νисп < νпогл, то Вэн < Вкв Квантовый выход люминесценции не зависит от λвозб вплоть до

некоторой λ, находящейся в области наложения спектров поглощения и испускания, после чего резко уменьшается. Энергетический выход зависит от λвозб: вначале он увеличивается прямо пропорционально λвозб , затем на некотором интервале не изменяет своей величины, после чего резко уменьшается (закон Вавилова).

21.2.4. Влияние различных факторов на интенсивность флуоресценции растворов

Люминесценция и, в частности, флуоресценция в гораздо большей степени подвержена влиянию различных факторов, чем поглощение света. Интенсивность флуоресценции зависит от:

•природы вещества;

•концентрации вещества в растворе;

•условий, в которых находится флуоресцирующее вещество

(температура, растворитель, рН, наличие в растворе других веществ, способных влиять на флуоресценцию).

Природа вещества

Неорганические соединения (за исключением некоторых соединений урана, лантанидов) обычно не способны флуоресцировать в растворе. В то же время среди органических соединений флуоресцирующих веществ достаточно много.

Необходимым (но не достаточным!) условием для фотолюми-

несценции является способность вещества поглощать электромагнитное излучение УФили видимого диапазона. Обычно веще-

ства, обладающие интенсивной флуоресценцией, имеют длинную систему сопряжённых связей. Наиболее часто флуоресцирующие вещества встречаются среди ароматических соединений. Введение в бен-

зольное кольцо электронодонорных заместителей увеличивает способность вещества флуоресцировать. Например, многие фенолы и ароматические амины обладают интенсивной флуоресценцией. Вве-

дение электроноакцепторных заместителей, за некоторым исключением, уменьшает флуоресценцию. Атомы тяжёлых галогенов

(Br, I) увеличивают скорость интеркомбинационной конверсии и, тем самым, уменьшают квантовый выход флуоресценции. Однако вве-

дение тяжёлых галогенов увеличивает способность вещества фосфо-

ресцировать. Способность вещества к флуоресценции в растворе

272

Инструментальные методы анализа

увеличивается при конденсации ароматических колец и увеличении «жёсткости» молекулы. Например

Концентрация вещества

Зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества в растворе более сложная, чем между поглощением света и концентрацией. Это связано с тем, что процесс излучения является вторичным и зависит от предшествующего ему процесса поглощения света.

Рассмотрим простейший случай, когда в растворе находится только одно флуоресцирующее вещество.

Следовательно, зависимость между интенсивностью флуо-

ресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества не является линейной.

Функцию 10−εlC можно разложить в ряд Маклорена

Если произведение εlС (оптическая плотность раствора) невелико, то 10−εlС ≈1 − 2,3εlC и тогда

If = 2,3kk′QεlC = KC

Таким образом, при малых значениях оптической плотности (при λвозб) зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации можно считать линейной, что и используется в количест-

венном анализе. При более высоких значениях A зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации становится более сложной и отклоняется от линейной. При A = 0,01 отклонение от линейности составляет 1%, 0,05 - 5%; 0,5 - около 35% (рис. 21.4).

273

Влияние оптической плотности раствора на интенсивность флуоресценции называется «эффектом внутреннего фильтра». Этот эффект обусловлен двумя причинами:

•поглощением возбуждающего света, вследствие чего частицы,

находящиеся дальше от источника излучения, будут получать меньше возбуждающего излучения;

•поглощением одними частицами вещества излучения, испускаемого другими частицами этого же вещества.

Условия, в которых находится флуоресцирующее вещество

Растворитель может оказывать влияние на величину разности между λmax спектра поглощения вещества (или спектра возбуждения флуоресценции) и спектра испускания. При увеличении диэлектрической проницаемости растворителя эта разность, называемая Стоксовым сдвигом, увеличивается. Растворитель влияет также и на величину квантового выхода флуоресценции, увеличивая её или уменьшая. Например, квантовый выход флуоресценции эозина в воде равен 0,2, а в ацетоне - близок к 1.

Влияние рН сказывается на флуоресценции тех веществ, в молекулах которых имеются функциональные группы, склонные к ки- слотно-основному взаимодействию. Например, фенол и его производные флуоресцируют в кислой среде, при ионизации фенольного гидроксила флуоресценция исчезает. Органические вещества, цвет и интенсивность флуоресценции которых изменяется при изменении рН, могут быть использованы в качестве кислотно-основных индикаторов (флуоресцеин, хинин и т.п.).

274

Инструментальные методы анализа

При повышении температуры увеличивается вероятность безызлучательных переходов, поэтому интенсивность флуоресценции уменьшается. Однако, у некоторых веществ свечение прекращается уже при -100°С, другие продолжают слабо флуоресцировать даже при >100°С. Если поместить флуоресцирующее вещество в специальную среду и охладить до температуры кипения жидкого азота (или даже жидкого гелия), то можно добиться того, что спектр флуоресценции органического вещества станет линейчатым. Такое явление называется эффектом Шпольского. Использование данного эффекта значительно повышает избирательность анализа и снижает предел обнаружения.

Интенсивность флуоресценции вещества и её квантовый выход могут снижаться в присутствии в растворе других веществ, называемых тушителями. Существуют, так называемые, универсальные тушители (например, O2), которые уменьшают флуоресценцию большинства веществ. Однако, чаще тушитель влияет на флуоресценцию одного вещества и не влияет на флуоресценцию другого (например, хлориды уменьшают интенсивность флуоресценции хинина), поскольку эффект тушения в разных случаях имеет различный механизм. Влияние концентрации тушителя на интенсивность флуоресценции вещества описывается уравнением Штерна-Фольмера

IIq =1 + kCq

где Iq - интенсивность флуоресценции в присутствии тушителя, Сq - концентрация тушителя, k - константа тушения.

21.2.5. Измерение аналитического сигнала

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5).

В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноновую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуоресценции применяют лазеры.

Для выделения нужного спектрального интервала в флуориметрах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохроматоры (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохроматор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным, а для выделения наиболее интенсивного излучения из спектра испускания - вторичным.

275

устройство для выделения спектрального интервала из испускаемого излучения

регистрирующее детектор устройство

Рис. 21.5. Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции

Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения,

чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуж-

дающего света. Такой приём позволяет избежать наложения возбуждающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфоресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использовать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге λвозб и λисп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается монохроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощающих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции проводится под углом 45° относительно возбуждающего излучения.

При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излучением, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как

вспектрофотометрии, а фотоумножители.

21.2.6.Практическое применение и основные приёмы люминесцентного анализа

Клюминесцентной спектроскопии относят:

•флуоресцентный метод анализа (флуориметрия),

•фосфоресцентный метод анализа (фосфориметрия),

•хеми- и биолюминесцентный метод анализа (люминометрия) и

др.

276

Инструментальные методы анализа

Наиболее широкое применение среди перечисленных люминесцентных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает:

•большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать);

•более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами);

•удобным временным диапазоном.

Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10-15 - 10-16 с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значительно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), меченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа, одного из современных методов анализа биологических объектов.

Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для количественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции определяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуоресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах.

Вколичественном анализе используют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, концентрацию которого необходимо определить.

Вфлуоресцентном анализе используется:

•измерение собственной флуоресценции вещества;

•получение флуоресцирующих продуктов, в том числе и экстракционная флуориметрия;

•определения, основанные на тушении флуоресценции;

•титрование с флуоресцентными индикаторами и др.

Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.

277

Раздел 3

Обратите внимание на особенности структуры флуоресцирующих веществ – наличие в составе их молекул конденсированных ароматических систем.

В основе реакций получения флуоресцирующих продуктов могут лежать различные процессы: окисления, конденсации, образование комплексных соединений, ионных ассоциатов и др. Если образующийся продукт мало растворим в воде, неустойчив в водном растворе, либо избыток реагента мешает определению или влияет на устойчивость продукта, применяют экстракционную флуориметрию. Иногда вещество не флуоресцирует или слабо флуоресцирует в водной среде, но интенсивно флуоресцирует в среде органического растворителя.

Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуоресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), β-лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д.

Кновым подходам в люминесцентной спектроскопии относятся:

•производная спектрофлуориметрия;

•синхронная спектрофлуориметрия;

•спектроскопия, основанная на эффекте Шпольского;

•флуоресцентная спектроскопия узких линий,

•фосфориметрия при комнатной температуре и др.

278