2. Лабораторные и инструментальные методы исследований

У всех детей до начала терапии проводился анализ периферической крови с подсчетом лейкоцитарной формулы и уровня эозинофилов, общий анализ мочи, биохимический анализ крови с определением показателей, характеризующих функции почек и печени (общий белок, мочевина, креатинин,

АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ), определялось содержание общего и специфических IgE. В ходе лечения проводился контроль общего анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы и уровня эозинофилов каждые 2 недели, биохимического анализа крови и общего анализа мочи каждые 4 недели, содержания общего IgE каждые 4 недели, а также в зависимости от режимов системной иммуносупрессивной терапии определялась концентрация циклоспорина А (CsA) в сыворотке крови каждые 2 недели до начала снижения дозы препарата. При наличии признаков бронхообструкции оценивалась функция внешнего дыхания (ФВД) с лекарственными пробами.

У ряда больных с различными клинико-патогенетическими вариантами АД до и после применения дифференцированной терапии оценивались основные показатели клеточного и гуморального иммунитета, цитокинового статуса, МИФ, уровень оксида азота, функциональное состояние нейтрофильных лейкоцитов, Toll-подобные рецепторы, образование антител под влиянием общей антигенной детерминанты.

Общий анализ крови проводился на автоматическом гематологическом анализаторе ABX Pentra 80 в режиме автоматической аспирации с определением 18 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, а также дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы), лейкоцитарная формула подсчитывалась после окраски мазка крови по Романовскому-Гимза (цитологическая клиническая лаборатория ФГБУ РДКБ Минздрава России, заведующая лабораторией – Л.В. Байдун).

Биохимический анализ крови (на биохимическом анализаторе в соответствии с рекомендациями производителя) и общий анализ мочи проводились в клинико-диагностической лаборатории ФГБУ РДКБ Минздрава России (заведующая лабораторией – Е.Г. Лукьянова).

Определение основных показателей клеточного и гуморального иммунитета осуществлялось в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ РДКБ Минздрава России (заведующая лабораторией – Л.А. Грачева).

Клеточное звено иммунитета оценивалось по количественному содержанию лейкоцитов, относительному (%) и абсолютному (в 1 мкл) содержанию лимфоцитов, Т-лимфоцитов (СDЗ+ клетки), их иммунорегуляторных субпопуляций: Т-хелперов (СD4+ клетки) и Т- супрессоров (СD8+клетки) – и их соотношению, которое показывало величину иммунорегуляторного индекса (ИPИ = CD4+/CD8+), a также содержанию Т- хелперов 2-го типа (СD30+ клеток). Для этого использовали моноклональные антитела научно-производственных центров «МедБиоСпектр» и «Сорбент» к дифференцировочным и активационным маркерам, меченных FITS. Фенотипирование лимфоцитов проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител. Количество Т- лимфоцитов (Т-л), В-лимфоцитов (В-л), Т-хелперов (Тh) и Т-супрессоров (Ts) определяли методом непрямой иммунофлуоресценции с помощью использования моноклональных антител серии BMA («Behring Monoclonal Antibodies», ФРГ) и меченными флуоресцином антителами к легким цепям иммуноглобулинов мыши. Лиофилизированные моноклональные антитела BMA 020 (В-л), BMA 030 (Т-л), BMA 040 (Тh) и BMA 081 (Ts) предварительно растворяли в фосфатном буфере на физиологическом растворе, в который добавляли 0,4% альбумина и 0,02% азида натрия. Антитела замораживали при – 70°С. Перед проведением реакции антитела размораживали и разводили 1:500. Реакцию проводили в лунках микроплат «Falcon» или «Flow Lab». На дно лунок наносили поли-L-лизин («Sigma», США) и инкубировали 30 мин при 37°С. После удаления остатков поли-L-лизина вносили 20 мкл суспензии

лимфоцитов (2×10⁶ клеток в 1мл среды) и также инкубировали при 37°С в

течение 30 мин. После тщательного удаления надосадочной жидкости из лунок вносили 20 мкл раствора моноклональных антител и инкубировали 30 мин при 4°С. Микроплаты после инкубирования тщательно отмывали в фосфатном буфере и вносили в лунки по 20 мкл меченных флуоресцеином антител к легким цепям иммуноглобулинов мышей. Вновь выдерживали при 4°С в течение 30 минут и также тщательно отмывали в фосфатном буфере, после чего

в каждую лунку вносили по 1-2 капли 50%-ного раствора глицерина. Подсчет светящихся клеток и их процентное содержание в опытных и контрольных лунках проводили с помощью люминесцентного микроскопа «Olimpus» (Япония).

Гуморальное звено иммунитета включало комплексную оценку относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов (CD-20+ клетки) и концентрации иммуноглобулинов классов G, A, M в сыворотке крови. Уровень иммуноглобулинов трех основных классов IgG, IgA, IgM определяли с использованием моноспецифических сывороток методом радиальной иммунодиффузии в геле по Manchini G в модификации лаборатории клинической иммунологии ФГБУ РДКБ Минздрава России, основанной на принципе партигенов. Принцип метода количественного определения иммуноглобулинов заключается в том, что исследуемые образцы сыворотки или плазмы помещают в лунки агара, который содержит антитела к иммуноглобулинам одного из классов (IgG, IgA или IgM) в известной концентрации. Иммуноглобулины образца, диффундирующие из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами будут образовывать кольца преципитации, размер которых находится в тесной зависимости от содержания в образце иммуноглобулинов соответствующего класса.

Оценка содержания общего и специфических IgE проводилась методом иммунонефелометрии на приборе Immage (Beckman Coulter) в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ РДКБ Минздрава России (заведующая лабораторией – Л.А. Грачева). В качестве нормальных значений общего и специфических IgE использовались референтные величины, предоставленные производителями диагностических наборов реактивов для определения вышеуказанных показателей.

Уровень цитокинов (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, INF-, TNF-α) в сыворотке крови оценивался методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов реактивов BioSource Camarillo (USA) с чувствительностью 1 пг/мл по методике, рекомендованной фирмой-

производителем, в лаборатории регуляции эритрона ФГБУ РДКБ Минздрава России и ФГБУ ФНКЦ ДГОИ имени Д. Рогачева Минздрава России (заведующая лабораторией – Н.С. Сметанина).

Для оценки состояния бронхолегочной системы детям старше 4-х лет с сочетанным поражением кожи и дерматореспираторного тракта проводилось исследование функции внешнего дыхания (ФВД), при выявлении признаков бронхиальной обструкции проводилось исследование ФВД после ингаляции Венталина (разовая доза рассчитывалась с учетом возраста). Исследование проводилось в отделении функциональной диагностики ФГБУ РДКБ Минздрава России (заведующая отделением – Н.Б. Сенякович).

Определение концентрации CsA в сыворотке крови (лекарственный мониторинг) проводили на приборе ARCHITECT i2000 в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ РДКБ Минздрава России (заведующая лабораторией – Л.А. Грачева).

Определение МИФ, эндогенного оксида азота, оценку функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов, Toll-подобных рецепторов и образования антител под влиянием общей антигенной детерминанты проводили в иммунологической лаборатории ФГБУ ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова Минздрава России (заведующая лабораторией – В.С. Сускова) и лаборатории регуляции эритрона ФГБУ ФНКЦ ДГОИ имени Д. Рогачева Минздрава России (заведующая лабораторией – Н.С. Сметанина).

Определение МИФ. Содержание МИФ в сыворотке крови и продукцию МИФ периферическими мононуклеарными клетками измеряли методом энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA). У пациентов проводился забор крови из вены в количестве 2-3 мл. Кровь помещалась в пробирку с гепарином (5-10 Ед/мл), перемешивалась и отстаивалась 20-40 минут при 37°С. Затем 0,5-1,0 мл отобранной плазмы с лейкоцитами центрифугировались при 1000 об/мин. Осадок, содержащий лейкоциты больных АД помещали в систему МигРоСкрин. После 18-20 часов культивирования при 37°С в СО₂–инкубаторе оценивалась площадь миграции

клеток, которая определялась балансом МИФ и МСФ. Для оценки соотношения МИФ/МСФ и анализа спонтанной клеточной миграции применяли скрининговый тест клеточной миграции из микрокультур (СМТК).

Определение уровня эндогенного оксида азота в сыворотке крови больных АД. Забор крови осуществлялся с применением системы Vacutainer TM, состоящей из двух компонентов:

1. комплекта для взятия крови BD Vacutainer с безопасно убирающейся иглой (Push Button);

2. вакуумной пробирки BD Vacutainer SST II.

После предварительной обработки места инъекции производился забор 5 мл крови из локтевой вены непосредственно в пробирку BD Vacutainer SST II, содержащую двойной активатор свертывания и разделительный гель - SST™II (Serum Separation Tube), образующий в процессе центрифугирования стабильный барьер между плазмой и клетками крови. Далее пробирка с полученной кровью переворачивалась 8-10 раз с целью полного смешивания крови с активатором свертывания, и пробирка оставлялась в штативе для 30- минутной экспозиции до полного свертывания крови. После этого подготовленный образец центрифугировался в центрифуге «ЭЛЕКОН» ЦЛМН- Р10-02 при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная сыворотка в количестве 2-2,5 мл забиралась в пробирки, устойчивые к замораживанию, замораживалась и хранились при температуре -25°С до следующего этапа исследования.

Количественный анализ содержания оксида азота (NO) в сыворотке крови оценивали по уровню его стабильных метаболитов – ионов NO₂+NO₃, определяемых спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра DU-50 (Beckman, США) при длине волны 520 нм.

Предварительную обработку образцов сыворотки для количественного определения метаболитов NO проводили следующим образом:

1. к 1 мл сыворотки крови добавлялось 100 мл 35% сульфосалициловой кислоты;

2. содержимое пробирки тщательно перемешивалось и выдерживалось в течение 30 минут при комнатной температуре;

3. в течение последующих 15-минут центрифугировалось со скоростью 7000 об/мин на центрифуге SIGMA 2-16P (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Германия) для полного осаждения белка.

Надосадочную жидкость после доведения ее pH введением 10 мл 5N раствора NaOH до 7,4-8,0 использовали для определения метаболитов оксида азота.

Учитывая, что в водной среде NO₂ крайне нестабилен и быстро переходит в NO₃, не регистрируемый спектрофотометрически, для количественного определения уровня оксида азота проводили предварительную обработку проб специальным индикаторным порошком, изготовленным ЭАА «Эко-аналитика» (МГУ). Индикаторный порошок представляет собой гомогенную сухую смесь, содержащую цинковый порошок, сульфаниловую и хромотроновую кислоты и катализатор диазотизирования. После растворения порошка в анализируемом растворе биологического образца происходит восстановление NO₃ в NO₂ (с выходом до 85%), который вступает в реакцию диазотирования – азосочетание с компонентом индикаторного порошка. При этом образуется окрашенное в красный цвет соединение в концентрации, пропорциональной содержанию нитрита в анализируемом растворе. Измерение оптической плотности образцов проводили через 15 минут после добавления реактива из расчета 20 мг индикатора на 1 мл образца. Расчет результатов производили по градуировочному графику, построенному по шести известным концентрациям NaNO₃, полученным по вышеуказанной методике.

Определение общей окислительно – восстановительной активности

нейтрофилов в тесте восстановление нитросинего тетразоля (НСТ-

тест).

Принцип метода основан на способности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий (НСТ) и восстанавливать его в гранулы нерастворимого дифермазана в виде гранул чёрного цвета. Восстановление НСТ обеспечивается

энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций и

«метаболического взрыва», сопровождающего процесс фагоцитоза, а также повышенного метаболизма активированного нейтрофила.

После инкубации в термостате гепаринизированной крови в течение 20 минут при температуре 37°С производят отбор лейковзвеси в плоскодонные пробирки. В первый ряд добавляют по 20 мк/л фосфатно–солевого буфера (спонтанный НСТ-тест), во второй - по 20 мк/л убитой культуры микробов Staphylococcus aureus (разводится по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича на 10 ед.) – индуцированный тест. После добавления нитросинего тетразоля проводят инкубацию в течение 30 минут при температуре 37°С. Далее выделяют клеточный монослой с образовавшимися зёрнами дифермозана и добавляют в лунки по 100 мк/л NaOH. После инкубации (15 минут при температуре 37°С) в каждую лунку добавляют диметилсульфаксид по 100 мк/л. Измерения проводятся спектрофотометрическим методом, устанавливается фильтр с длиной волны 650 нм («PICON» incorporated company, программа 20, измерение по лунке А1, содержащей диметилсульфаксид 100 мк/л и 20 мк/л фосфатно–солевого буфера). После измерений в 1-м и 2-м столбцах определяется среднее значение.

Метод оценки аффинности антител к общей антигенной детерминанте.

Аффинность антител оценивали с помощью относительной величины

RHAV (Relative High Affinity Vallue) по Luxtion и E.Thompson. Определяли аффинность антител к общей антигенной детерминанте (ОАД) всех бактерий, конъюгированной с бычьим сывороточным альбумином в сыворотке крови человека, применяя различные молярные концентрации тиоцианата натрия (Sigma), разрушающего связи комплекса антиген–антитело на пластике в ИФА. О степени аффинности судили по разнице оптической плотности до и после обработки комплекса тиоцианатом натрия. В ходе постановки реакции брали сыворотку больных в разведении, дающем при длине волны 492 нм оптическую плотность 1000-1500 единиц. После фиксации антител на антигене и

последующей отмывки в лунки добавляли тиоцианат натрия (Sigma) в концентрациях 3,5; 4,0; 4,5; и 5,0 и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем с помощью конъюгата антител к IgG человека, меченных пероксидазой хрена (Sigma), проявляли реакцию и определяли относительную аффинность антител по формуле:

RHAV=A1x12+A2х11+А3х10+А4х9,

где А1, А2, А3, А4 – процент антител, оставшихся в лунках после их обработки тиоцианатом натрия в концентрациях соответственно 5,0; 4,5; 4,0 и 3,5 М.

Определение экспрессии TLR2 и TLR4. Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на клетках периферической крови выделенные на градиенте фиколл-урографина мононуклеарные клетки инкубировали с FITC-меченными антителами к СD14+, РЕ-меченными антителами к TLR2 и TLR4 с соответствующими изотипическими контролями в течение 30 мин при температуре 4°С. Анализ экспрессии CD 14+, TLR2 и TLR4 проводили на проточном цитофлуориметре. Оценивали процент моноцитов (CD 14+ клеток), несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4, и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флуоресценции.

Контрольную группу для определения нормальных значений ряда указанных выше иммунных и неспецифических показателей составили 30 здоровых по кожным и атопическим заболеваниям детей в возрасте от 3-х до 17-ти лет.

Таким образом, мы постарались использовать весь доступный спектр клинико-лабораторных показателей, а также диагностических исследований с применением современной контрольно-измерительной аппаратуры.

Поскольку изучение механизмов патогенеза и лечения АД является основным запланированным направлением научно-исследовательской работы кафедры, в котором участвует весь ее коллектив, часть исследований проведена совместно с аспирантами кафедры В.Н. Коротким и В.А. Хархарьян.