Глава 1. Обзор литературы

ГА представляет собой воспалительное заболевание ВФ, медиированное цитотоксическими Т-лимфоцитамив в условиях нарушения иммунной толерантности анагеновыми фолликулами. Несмотря на то, что заболевание известно со времён Гиппократа, его причина до сих пор продолжает оставаться загадкой. Этиология и патогенез ГА долгое время пытались изучить с помощью исследования различных параметров периферической крови. Между тем современные знания в области биологии и морфологии волоса заставляют по- новому взглянуть на ВФ и признать, что, несмотря на миниатюрные размеры, устройство ВФ не менее сложное, чем строение других органов и систем, и его функционирование – весьма сложно для понимания и может быть сравнимо, к примеру, с функционированием яичника – другого аналогичного органа с циклирующим механизмом развития. Миниатюрные размеры ВФ как органа определяют механизмы регулирования его функции на клеточном и молекулярярном уровнях и диктуют необходимость изучения развития патологии на местном, регионарном уровне. Морфологические изменения, происходящие в циклирующем ВФ, обусловлены тонкой настройкой межклеточных дермо- эпидеральных и мезенхимальных взаимодействий, осуществляемых определёнными сигнальными молекулами, факторами роста, нейротропинами, Wnt-сигнальными путями, межклеточными цитокинами, лигандами и их рецепторами. Сложность изучения патогенеза ГА обусловлена, во-первых,

отсутствием понимания природы цикличности роста здорового волоса, во-вторых

• отсутствием ясности в этиологии самой болезни и недостаточным пониманием межклеточных механизмов патологического процесса. Поэтому в обзоре литературы приведены факты, касающиеся современных научных знаний клеточно-молекулярных механизмов функционирования здорового ВФ и научных данных в области исследования патогенеза ГА, а также рассмотрены современные методы патогенетической терапии заболевания.

1. Физиология волосяного фолликула

1. Рост и развитие вф, апоптоз и стволовые клетки

Морфогенез фолликула и повторяющаяся цикличность роста волос – различные явления, каждое из которых имеет свои морфологические и молекулярные особенности (рис. 1) [184, 228]. Морфогенетически структура ВФ формируется во время внутриутробного развития плода, но затем в течение жизни происходит неоднократное повторение циклов волоса, растущего из ВФ.

ВФ представляет собой прототип развивающейся системы. Во время каждого цикла роста волоса ВФ формируется и регрессирует, используя процессы клеточного моделирования. Во время фазы анагена клетки активно пролиферируют в луковичной зоне фолликула. В промежуточную фазу, называемую катагеном, наблюдается постепенная инволюция органа, характеризующаяся контролируемым апоптозом эпителиальных клеток в нижней части фолликула [148, 258], после чего ВФ вступает в латентное состояние – фазу телогена.

Апоптоз играет непосредственную роль в поддержке эпителиального регресса ВФ, поэтому его можно считать центральным элементом цикличного функционирования фолликула. Некроз клеток, происходящий в фазе катагена, является программируемой клеточной гибелью, поскольку время инициирования апоптоза предсказуемо. При этом неизвестно, что является инициирующим сигналом. Морфологически апоптоз достаточно заметен в делящихся клеточных

популяциях при рутинной световой и электронной микроскопии. Характерные

морфологические изменения включают сморщивание клетки, потерю межклеточных контактов, уплотнение (конденсацию) хроматина, утрату цитоскелета, фрагментацию и сморщивание ядра, цитоплазматическую эозинофилию.

Рис.1 Фазы морфогенеза (обозначены цифрами) и цикл ВФ (круг в центре), повторяющийся после морфогенеза. Хотя морфогенетическое формирование фолликула как органа происходит только однажды в жизни, цикл его развития повторяется многократно. Морфогенез и цикличность – различные явления, они имеют свои морфологические и молекулярные особенности (см. текст). DP – дермальный сосочек (волоса); SG – сальная железа; APM – мышца, поднимающая волос; HS – шахта волоса; mel – меланин; BM – базальная мембрана; POD – запрограммированное удаление органа; HF – волосяной фолликул; ORS – внешнее влагалище корня; IRS – внутреннее влагалище корня (по [184, 228])

Фрагментацию клетки и фагоцитоз апоптозной ткани осуществляют реактивные гистиоциты или примыкающие к ткани клетки [150].

Гибель клеток путём апоптоза не зависит от вида клеток и сопровождается деградацией ДНК, которая является детектором возникших необратимых изменений [268]. Поэтому апоптоз можно обнаруживать и определять количественно при маркировке концов фрагментированных участков ДНК с помощью терминальной трансферазы (TUNEL – введение концевой метки биотинилированным dUTP с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы), которая обладает способностью инкорпорировать меченые нуклеотиды в места разрыва цепи ДНК [97].

Позитивность TUNEL в отношении цикла роста волос была изучена на мышах [148, 159], морских свинках [125], и людях [110, 229]. Апоптозные кератиноциты выглядят как чётко определяемые группы [148]. Расположение TUNEL-позитивных клеток указывает, что апоптоз играет непосредственную роль в поддержке эпителиального регресса ВФ: сначала апоптозные клетки выявляются в проксимальных кератиноцитах фолликула вокруг волосяного сосочка, потом – в глубоком (проксимальном) центральном эпителиальном тяже, затем (со временем) – в дистальном регрессирующем эпителиальном тяже [148, 173]. В середине катагена апоптотические клетки наиболее многочисленны в области луковицы, НЭКВ, центральной части внутреннего влагалища корня (ВВК), а также в перешейке (истмусе), зоне выпуклости – bulge, и в области сальных желез [148, 175]. Анагеновые фолликулы также содержат апоптозные

TUNEL⁺-клетки, но в меньшем количестве. При этом следует разделять

терминальную дифференцировку кератиноцитов и подлинный апоптоз [94, 155].

Остаётся неясно, что служит сигналом к апоптозу в катагене и значимо ли место его возникновения (эпителий, мезенхима, иммунные клетки). Некоторые авторы полагают, что сигналом являются секреция или делеция паракринных

цитокинов, колебания уровня кальция, нейронная сигнализация, изменения экспрессии молекул. Механизм запуска апоптоза связан с каскадом биохимических реакций, которые инициируют пертурбации на поверхности клеточной мембраны или возникают посредством взаимодействия: рецептор сигнала/специфический лиганд. Например, рецептор Apo1/Fas или рецептор фактора некроза опухоли (TNFR) и их лиганды – соответственно FasL и TNF, или определенные trk- тирозинкиназные рецепторы нейротропинов – такие, как фактор роста нервов (NGF), и рецептор p75 [84, 257], или воздействия посредством митохондриальных сигнальных путей, например, посредством цитохрома c. Эти сигналы инициируют процесс апоптоза и передают его в клетку через каскад ферментов – каспаз. При этом инициирующие каспазы активизируют терминальные, которые приводят к активизации определенных дезоксирибонуклеаз, способных безвозвратно денатурировать ДНК хозяина и приводить к формированию «лестничной» ДНК [74, 76, 257].

Чтобы уравновесить систему проактиваторных ферментов, существует группа белков, которые уменьшают или блокируют сигнал апоптоза [55, 131].

Семейство антиапоптозных медиаторов – семейство ингибиторов факторов апоптоза, обусловливают TNF-зависимый путь передачи сигнала апоптоза. Мутации членов этого семейства способны вызвать у человека заболевания [55].

Самым известным семейством белков-медиаторов апоптоза, способным как подавлять, так и усиливать апоптозный сигнал, являются независимые действующие члены семейства белков bcl-2 [126, 128]. Впервые ген bcl-2 был описан как транслоцируемый ген в клетках фолликулярной лимфомы, способный ингибировать апоптоз. В дальнейших исследованиях выяснилось, что bcl-2 является мультигеном и все вещества, относящиеся к данному классу, поразделяются на активаторы и ингибиторы апоптоза (на агонистов и антагонистов). При этом ингибиторами апоптоза являются белки bcl-2, bcl-XL, Ced-9, bcl-w, и Mcl-1, аденовирусный E1B 19K, Эпштейна–Барр-вирусный

BHRF1. Активаторами апоптоза являются другие bcl-2-гомологи: 1–3, bax-

подобный белок, bak, bok и состоящие только из BH3 региона, Bad-подобный белок, Bid, Bik, Bim, и Hrk [27, 128].

Bcl-2 действует, стабилизируя митохондриальные мембраны и образуя комплексы с каспазами, или как усилитель действия каспаз [27, 65].

В развивающемся ВФ bcl-2 выражен в эпителии на ранних стадиях морфогенеза, равно как и в окружающей мезенхиме. Bcl-2⁺-клетки обнаруживают в матричном эпителии, смежном с волосяным сосочком, а также в области региона bulge у мышей и в фолликулах человека [138, 148, 155]. Во взрослом ВФ bcl-2 выражен в фолликулярном сосочке на всех стадиях цикла [148]. В анагене он обнаруживается в луковице, проксимальном ВВК, НЭВК и в зоне bulge. Полагают, что позитивность зоны bulge в отношении bcl-2 напоминает другие стволовые клетки областей тела [138].

С развитием катагена отмечается прогрессирующее снижение экспрессии bcl-2 в фолликулярном эпителии [148]. Логично предположить, что экспрессия bcl-2 защищает клетки от программируемой клеточной гибели и поэтому очень важна для нормального роста волос.

В опытах in vitro установлено, что ингибировать удлинение стержня волоса, изменять его морфологию и повышать гибель матричных клеток луковицы способен TNFα в дозозависимом режиме [229]. В основе патологического воспаления при ГА лежит цитотоксическое воздействие активированных CD4⁺- лимфоцитов с гиперпродукцией TNFα в сочетании с другими провоспалительными цитокинами, такими, как IL2 и IFNγ. Поскольку данные эффекторные цитокины способны выступать в качестве индукторов апоптоза, изучение Fas/FasL-пути апоптоза позволит инициировать ключевые механизмы повреждения клеток ВФ при ГА.

Естесственное физиологическое завершение катагена ведёт к терминальному завершению эпителиального регресса ВФ – телогену. Возобновление дермоэпидермальных взаимодействий сосочка волоса и

мезенхимы ведет к конверсии анагена, что проявляется возобновлением

пролиферации и дифференцировки трихоцитов, регенерацией фолликула и ресинтезом волосяного волокна.

В период анагена ВФ представляет собой высокоактивную митотическую единицу за счёт регенерации матричных клеток волосяной луковицы. О запуске регенераторных процессов ВФ информируют специфические регуляторные сигналы, поступающие от сосочка волоса и его «ниши» – мезенхимального окружения. Формирование всех типов клеток ВФ обусловлено пролиферацией и дифференцировкой стволовых клеток (СК) фолликула. Стволовость клеток определяют такие свойства, как их малочисленность, редкое распределение (медленно циклирующие клетки); их способность производить временно делящиеся клетки в ответ на специфические стимулы; локализацию в строго определённых хорошо защищенных и хорошо васкуляризованных местах (нишах); для СК характерны однообразные (недифференцированные) свойства и низкая колониеобразующая способность.

Ещё в середине 50-х годов прошлого столетия была описана эквипотенциальность неделящегося «постоянного» эпителия верхней части НЭВК фолликула. В частности, указаны такие его свойства, как способность восстанавливать заново потерянный эпидермис во время заживления раны, а также давать начало новой сальной железе и служить «зачатком» ВФ при наличии кожного сосочка [51]. Клетки, отвечающие изложенным выше характеристикам, были найдены в области фолликула мышей на уровне участка прикрепления мускула, поднимающего волос – в области выпуклости (bulge) – анатомического перешейка ВФ [63, 170]. Оказалось, что клетки bulge, представляющие собой медленно циклирующие клетки (более чем 14 мес у мышей), которые относительно недифференцированны и расположены в безопасной, хорошо питаемой окружающей среде, крайне необходимы для цикличности фолликула [169]. Эти клетки имеют извитые ядра, которые отражают их пролиферативную бездеятельность [63]. Кроме того, в области bulge и несколько ниже есть

колониеформирующие эпителиальные клетки с наибольшей по сравнению с

клетками других фолликулярных уровней возможностью формировать колонии в культуре (голоклоны или мероклоны). Аналогичные клетки ВФ, расположенные глубже места прикрепления мышцы, поднимающей волос, обнаружены также и у людей [127, 206].

Биохимические исследования также подтвердили предположение об уникальности клеток зоны bulge и окружающей её мезенхимы. Выяснилось, что клетки bulge богаты кератином 15 (СК15) [152], кератином 19 (K19) [136], они

имеют рецептор эпидермального фактора роста (EGF), _{2 1}- и _{3 1}-интегрины [117], высокий уровень ₆-интегрина и низкий уровень маркёра быстрого увеличения 10G7 [142]. M. Matic и соавт. выявили, что среди K19⁺-клеток зоны bulge есть субтип, испытывающий недостаток в определенном маркере дифференцировки,

белке промежуточного соединения коннексине 43 (Cx43), на основании чего этот тип клеток был предложен на роль фактических СК [158]. При этом однозначный маркёр клеток ВФ на стволовость не выявлен, поэтому данные находки лишь позволяют обозначить область возможной локализации СК в ВФ. Y. Liu, G. Cotsarelis и соавт. [149] определили, что клетки зоны bulge имеют высокий уровень экспрессии белка кератина 15, и предложили использовать позитивные по кератину 15-клетки в качестве маркёров дифференцировки трихоцитов.

Другую возможную нишу обитания клеток с эффектом стволовости продемонстрировали исследования, которые показали способность дермальных клеток волосяного влагалища регенерировать волосяной сосочек [116, 178, 203]. А у клеток волосяного сосочка немногим позднее были определены свойства к организации регенерации целого органа кожи из отделённых эпителиально- мезенхимальных клеток [146, 199, 204]. В одном из экспериментов удалось продемонстрировать кожную регенерацию и полное восстановление ВФ, начиная с эпидермальных клеток новорожденной мыши и клонирования клеток волосяного сосочка. Эксперимент проводили с целью определения эпителиально- мезенхимальных взаимодействий в формировании придатка кожи.

Формирующиеся клетки герменативной зоны волоса соединили с

приготовленными различным образом мезенхимальными клетками. В результате удалось показать возможность восстановления почти полной кожи с неповреждёнными слоями эпидермиса и дермы-плюс терминальными фолликулами волос. Было установлено, что характером восстанавливаемой кожи можно управлять с помощью определённых мезенхимальных компонентов. Нехватка клеток кожи приводила к шраму, тогда как включение отделённых клеток в присутствии фолликулярных фибробластов волосяного сосочка обусловливало почти полную регенерацию кожи [200].

Эти эксперименты показали, что в области дермального сосочка ВФ также обитают мезенхимальные клетки со свойствами стволовости.

Более полное представление о СК ВФ и их нишах удалось получить в последние годы. Можно считать установленным, что в ВФ имеются 2 популяции СК, одна из которых расположена в дермальном сосочке нижней части фолликула, а другая – в верхней его части в зоне утолщения bulge [64]. При этом верхняя и нижняя ниши, содержащие K19⁺-клетки, не идентичны. Они экспрессируют различные маркеры и демонстрируют разный состав окружающей соединительнотканной оболочки. Верхний резервуар выделяет высокие уровни кератина 15 (СК15) и β1-интегрина (CD29) и в большой степени состоит из Кi67- клеток (непролиферативных), в то время как нижний резервуар, также содержащий СК15- и CD29-клетки, выделяет CD34 – мембранный белок, опосредующий связывание СК с внеклеточным матриксом, а также охватывает некоторые Кi67⁺-клетки [61].

Несмотря на многообразие предложенных кандидатов на роль СК ВФ,

наиболее надежным ИГХ-маркером в парафиновых срезах для зоны bulge ВФ человека является цитокератин СК15. Иммунореактивность СК15 выявляется во всех фазах роста в периферическом слое НЭВК, на уровне перешейка, специфически проявляется от входа в проток сальной железы ниже, до места прикрепления m.arrector pili. Другие СК15⁺-структуры кожи – базальные клетки

эпидермиса и секреторные клетки потовых желез [192].

Таким образом, исследование CK15⁺-клеток ВФ при ГА позволит судить о векторе направленности патологических повреждений ткани волоса, а также о динамике его возможной регенерации в патологических условиях.

Изменение апоптоза влияет на баланс между дифференциацией и пролиферацией клеток ВФ. Изучение распределения Кi64⁺-клеток в сочетании с выявлением bcl-2⁺ и CK15⁺-клеток ВФ позволит уточнить особенность нарушений гомеостаза в тканях с ГА с учётом оценки процессов пролиферации и дифференцировки клеток ВФ в динамике, изучение Fas-FasL-пути апоптоза будет способствовать инициации ключевых механизмов повреждения клеток ВФ при

ГА и, возможно, в какой-то степени объяснит процессы, лежащие в основе развития заболевания и его регресса.