Особенности пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток, а также процесса ангиогенеза при га
Ткани организма характеризуются определённым постоянством качественного и количественного состава. Тканевой гомеостаз обеспечивается балансом между такими фундаментальными процессами, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз клеток. Каждый из указанных механизмов играет определённую роль в тканевом гомеостазе и строго регулируется. Поскольку их нарушение лежит в основе ряда кожных заболеваний, следующим этапом работы было подробное исследование каждого из этих процессов при ГА путём изучения их основных ИГХ-маркёров и сравнения с показателями у здоровых людей.
ИГХ-характеристика тканевого гомеостаза ВФ и перифолликулярных областей у здоровых доноров
Клетки, экспрессирующие CK15, были выявлены в наружном эпителиальном влагалище фолликула, преимущественно в зоне, прилегающей к мышце, поднимающей волос (зона bulge) и в зоне волосяного сосочка в нижней части луковицы (рис. 12, А). Ki67+ и bcl-2+-клетки выявлялись в зоне базальной мембраны эпидермиса и в области наружного эпителиального влагалища корня НЭВК (рис. 12, Б, В). Fas+ и VEGF+-клетки выявлялись в единичных
эпителиальных клетках дермального сосочка, FasL+-клетки в биоптатах здоровых доноров не выявлены (рис. 12, Г). При TUNEL-тесте обнаружено низкое содержание Apo-клеток в НЭВК. Количественное распределение клеток, ИГХ- маркёров гомеостаза в биоптатах здоровых людей представлено в табл. 11.
А Б
В Г
Рис. 12. Результаты ИГХ-исследования – реакция с антителами: А – к CK15, ×100; Б – к Ki67, ×100; В – к bcl-2,
×200; Г – к FasL, ×400
Таблица 16
Распределение ИГХ-маркёров гомеостаза (M±m, %) в ВФ в норме
(Контроль)
-
ИГХ-маркёр
Количество клеток
Ki67+
16±1,0
Bcl-2+
28,7±1,1
CK15+
26±1,5
VEGF+
эпителий дермального сосочка
дерма
2,7±0,3
0
CD95+
5,1±0,4
FasL+
0
Apo+
0,09±0,02
Таким образом, проведенное исследование показало, что состояние тканевого гомеостаза в здоровом анагеновом ВФ поддерживается за счёт балланса между процессами пролиферации и дифференцировки, формируемого в контроле программируемой гибелью клеток с участием противоапоптозного белка bcl-2, выявляемого в клетках матричной зоны ВФ.
ИГХ- характеристика нарушений тканевого гомеостаза у пациентов с
активной стадией ГА
Экспрессия CK15 наблюдалась в базальном слое покровного эпителия, но практически не выявлялась в фоллликулярном эпителии, что, вероятно, связано с отсутствием синтеза волосяного волокна (рис. 13, А, Б).
В активную стадию ГА наблюдалось уменьшение количества Ki67+-клеток
до 4,6%, которые выявлялись в основании ВФ и в базальном слое эпидермиса (рис. 13, В, Г). О том, что пролиферация в острой фазе ГА значительно понижена, свидетельствовало также отсутствие bcl-2+-клеток в эпителиоцитах ВФ (рис. 13, Д, Е).
А |
Б |
В |
Г |
Д |
Е |
Рис. 13. ИГХ-реакция с атителами: А – к CK15, ×100; Б – к CK15, ×400; В – к Ki67, ×200; Г –к Ki67, ×100;
Исследование процессов апоптоза. Исследование апоптоза с помощью TUNEL-теста позволило обнаружить апоптозные тельца среди клеток эпителия НЭВК как в зоне утолщения bulge (зоне стволовых клеток), так и в нижней части ВФ (34‰ против 0,09‰ в контроле, р□0,0001). Апоптоз в активную стадию ГА носил выраженный характер (рис. 14, А). В тех же зонах, где обнаруживались апоптозные тельца (в зоне bulge и в нижней части ВФ), на кератиноцитах ВФ выявлялись до 90% клеток с Fas/Apo-рецепторами CD95+ (рис. 14, Б, В). В воспалительном инфильтрате выявлялось 54% клеток с FasL (рис. 14, Г–Е).
А Б
В Г
Д Е
Рис. 14. Исследование процессов апоптоза: А – методом TUNEL, ×400; Б – ИГХ-реакцией с антителами к Fas (CD95), ×400; В – к Fas (CD95), ×200; Г–Е – ИГХ-реакцией с антителами к FasL (CD95L), соответственно ×200,
×400, ×400
Умеренное количество VEGF обнаруживали в эпителии, эндотелии сосудов и в клетках инфильтрата (до 12% клеток каждого типа) (рис. 15).
Рис. 15. ИГХ-распределение (%) ключевых маркёров гомеостаза и сосудистого фактора в образцах ткани с
активной ГА и в контроле
Таким образом, повреждение ВФ в активную фазу патологического процесса происходит вследствие апоптоза клеток отдельных его частей, который
осуществляется по иммунному механизму при взаимодействии FasL- эффекторных клеток воспалительного инфильтрата и Fas/Apo-рецепторов фолликулярного эпителия НЭВК волоса.
Процесс апоптоза сопровождается отсутствием экспрессии bcl-2 и уменьшением числа пролиферирующих Ki67+-клеток. Прекращаются процессы дифференцировки кератиноцитов эпителиальной выстилки ВФ, наблюдается умеренный ангиогенез, который регулируется макрофагальными элементами воспалительного инфильтрата и отчасти эндотелием предсуществующих сосудов.
ИГХ-особенности нарушений тканевого гомеостаза у пациентов с
хронической ГА
Экспрессия CК15 выявлялась в эпителии наружной оболочки зоны bulge и в зоне волосяного сосочка, а также в отдельных клетках между этими зонами, составляя около 10% (рис. 16, А; табл. 12).
В отличие от активной стадии, при которой наблюдаются снижение пролиферативной активности и отсутствие процессов дифференцировки, в хронической стадии отмечается расширение зоны пролиферации клеток в инфундибулярной области, а также в области bulge (рис. 16, Б). Ki67 выявляется в 9,4% эпителиоцитов. В матричной зоне ВФ в области дермального сосочка обнаруживаются bcl-2+-клетки (16,1±0,4%), отсутствовавшие в активной стадии заболевания (рис. 16, В; табл. 12), а также единичные воспалительные клетки с FasL (1,3±0,1%) в скудном воспалительном инфильтрате (рис. 16, Г, Д) и умеренное количество СD95+ эпителиоцитов, в основном на поверхности клеток внутренней оболочки корня волоса (24±1,3%).
А Б
В
Г Д
Рис. 16. ИГХ-реакция с антителами: А – к CK15, ×200; Б – к Ki67, ×200; В – к bcl-2, ×400; Г – к Fas (CD95), ×400;
Д – к FasL (CD95L), ×100
Уровень апоптоза в хроническую стадию ГА был менее выраженным (рис. 17). Это связано с выраженной деструкцией волосяного волокна. TUNEL-тест выявлял единичные апоптозные тельца (1,3±0,1%), но ихуровень почти десятикратно превышал показатели в здоровых контролях. Экспрессия VEGF в хроническую стадию ГА отсутствовала в дерме, но сохранялась в единичных эпителиальных клетках дермального сосочка.
.
Рис. 17. Апоптоз при ГА
Таким образом, клинические признаки снижения активности патологического процесса сопровождаются уменьшением плотности воспалительного инфильтрата, среди клеток которого преобладают тканевые макрофаги (ведущие клетки процессов регенерации тканей) выраженным снижением детекции апоптозных телец, отсутствием VEGF+-клеток в дерме, но с сохранением их небольшого количества в эпителиоцитах дермального сосочка, появлением в матричной зоне ВФ небольшого количества Кi67+-, bcl-2+- и CK15+- клеток (табл. 12). Кроме того, синтезирующие СК15+ эпителиоциты появлялись в области, включающей зону bulge. Всё вместе это свидетельствует о процессах частичной репарации в ВФ.
Вместе с тем при продолжительности заболевания >2 лет процессы репарации ВФ сопровождаются его атрофией с развитием склеротических изменений и накоплением фибробластических элементов, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагеновых волокон, и склерозированием микрососудов.
Таблица 12
ИГХ-распределение ключевых маркёров гомеостаза и сосудистого фактора в образцах ткани при ГА и в контроле (M±m, %)
-
Маркёр до лечения
Активная стадия
Хроническая стадия
Контроль
Ki67
4,6±0,3**
*9,4±0,3
15,9±1,0
Bcl-2
0
16,1±0,4*
28,7±1,1
CK15
0
10,2±0,5*
26±1,5
VEGF
12,5±0,6
**0,2±0,1
0
- дерма
- эпителий дермального
11,6±0,3**
**4,4±0,4
2,7±0,3
сосочка
Примечание *различия достоверны с вероятностью ошибки р≤0,03
**различия достоверны с вероятностью ошибки p≤0,006
Значок слева – различия между формами
Значок справа – различия по сравнению с контролем