- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
Животным второй контрольной группы проводили инъекцию 1 мл питательной среды для культивации. Зона и техника введения препаратов контрольным животным были идентичными манипуляциям, проведенным на крысах основных групп.
2.2.2.3 Ранотензиометрия
На 7 сутки во всех экспериментальных группах проводили ранотензиометрию с помощью тензиометра, представляющего собой силонагружающее устройство в виде винтового сердечника, один конец которого через измерительный прибор и съемное крепление соединяли с исследуемой полоской ткани. Противоположный конец тканевого образца закрепляли в неподвижном фиксирующем элементе прибора. Примененная техника ранотензиометрии была описана в работе В.Ф. Дыдыкина (1998) [51].
Использовали полоски кожи длиной 25 мм, шириной 20 мм, толщиной 1 мм, так, чтобы в центре исследуемого участка кожи находился послеоперационный рубец. Кожные швы предварительно снимали на 6 сутки. Растягивание проводили плавным усилием с небольшими интервалами от 1 до 200г до появления диастаза тканей.
2.2.3. Методы лабораторного контроля
2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
Определение биохимических показателей сыворотки крови подопытных крыс проводили в лаборатории биохимии (зав. – С.Д. Ежикеева) Иркутской государственной Ордена «Знак Почета» областной клинической больницы (гл. врач - Заслуженный врач Российской Федерации канд. мед. наук Ю.Л. Птиченко) на анализаторе «Синхрон-5» (Beckman, США). Кровь для исследований забирали из бедренной вены подопытных крыс под эфирным наркозом. Животных фиксировали к операционному столику в положении на спине. После антисептической обработки операционного поля рассекали кожу на внутренней стороне бедра, обнажали сосуд и проводили венепункцию. Кровь центрифугировали в течение 20 минут в лабораторной центрифуге ОПН-3, с угловой скоростью 3000 об.\мин. Полученную сыворотку собирали микропипеткой и замораживали при температуре –70о С.
Исследование всех заготовленных образцов проводили в одной серии с использованием стандартного набора реактивов.
Для определения нормальных показателей использована сыворотка крови 6 здоровых крыс. Исследовали концентрацию общего белка (г/л), альбумина (г/л), показатели активности аланинаминотрансферазы (МЕ/л), аспартатаминотрансферазы (МЕ/л), холинэстеразы (МЕ/л), лейцинаминопептидазы (МЕ/л) в сыворотке крови 6 подопытных крыс каждой группы на 7, 14 и 21 сутки эксперимента. Исключение составила КГ-2, в которой выполнение лабораторных исследований проводили только на 7 сутки эксперимента.
Для количественной оценки процентного соотношения белковых фракций проводили электрофоретическое исследование. Белки сыворотки крови разделяли методом электорофореза в 1% агарозе при рН 8,6 с трисбарбитуратным буфером. Применяли прибор для горизонтального электрофореза Multiphor и лазерный денситометр Ultroscan-2202 (LKB, Швеция) [35]. Исследование белкового спектра проводили в лаборатории биохимических исследований НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (зав. - канд. биол. наук С.Л. Богородская).