Заключение

Синдром постспленэктомического гипоспленизма – это патологическое состояние, вызываемое полной аспленизацией организма [8,11]. Одним из ранних и наиболее грозных проявлений СПГ является снижение антимикробной резистентности организма, которое реализуется повышенной чувствительностью к хирургической инфекции в раннем послеоперационном периоде [168]. Развиваются гнойно-воспалительные тромбоэмболические осложнения, особенно у пациентов с заболеваниями крови [145,154,201,205,297] и после комбинированных гастроспленэктомий по поводу рака желудка [64,187,324,339,346] и других расширенных онкологических операций [195,324].

Частота гнойно–воспалительных осложнений в раннем послеоперационном периоде достигает 13-30% [181], причем преобладают легочно-плевральные [43,211], внутрибрюшные и раневые [149,164] процессы. Летальность при возникновении осложнений достигает 16-30% [164,277]. Отсюда следует, что проблема профилактики раннего СПГ чрезвычайно актуальна. В этой связи в госпитальной хирургической клинике Иркутского государственного медицинского университета внедрены дифференцированные подходы к органосохраняющим вмешательствам на селезенке при ее повреждениях и патологических процессах живота (исключая болезни системы крови) [43].

При вынужденной СЭ способом коррекции СПГ является ЭП АТС [8]. Показано, что профилактика ПСГ путем АТС существенно снижает риск смерти у пациентов, перенесших дистальную резекцию ПЖ со спленэктомией по поводу деструктивного панкреатита. [11].

Между тем, существуют ситуации, при которых профилактика или коррекция ПСГ путем сохранения аутологичной ткани селезенки in situ или в гетеротопической позиции теоретически невозможна, например, при тотальном вовлечении пульпы в патологический процесс, в условиях декомпенсированного шока, при гематологических заболеваниях [43]. Предлагаемые способы предупреждения инфекционных гипоспленических осложнений, такие как вакцинация, пожизненное назначение антибиотиков, не представляются патогенетически обоснованными, поскольку направлены против ограниченного спектра возбудителей хирургической инфекции [221,249,280,298,336].

С другой стороны, к настоящему времени накоплен довольно обширный опыт применения свиной селезенки в комплексном лечении гнойно-септических процессов [28,111,130,137], а трансплантация материала свиных островков Лангерганса нашла применение для коррекции сахарного диабета [112,285,344]. Этические аспекты трансплантации делают более предпочтительным использование свиного материала по сравнению с гомологичными, тем более, абортными тканями [138,185,276].

Технология выделения изолированных клеток паренхиматозных органов и их ассоциаций, а также длительной криоконсервации заготовленного материала позволяет создавать достаточные резервы клеточного материала для использования в необходимом количестве по требованию [78,139,159].

Названные обстоятельства послужили основой для формулировки исходной гипотезы исследования: ксенотрансплантация клеток свиной селезенки – эффективный способ профилактики СПГ.

Проведенная работа посвящена экспериментальной проверке представленной гипотезы. В качестве реципиентов использованы крысы, ткани которых намного менее совместимы со свиными по сравнению с гистосовместимостью человека и свиньи [291,363].

Предполагалось, что реакция отторжения материала, пересаженного человеку, намного меньше, чем при введения крысе. То же допущение было сделано в отношении реакции «трансплантат против хозяина». Эффективность процедуры оценена лишь в раннем послеоперационном периоде. Это сделано в связи тем, что ранние гипоспленические нарушения особенно манифестны не только в клинике, но и в эксперименте (известна высокая летальность у крыс после спленэктомии [14,45]), тогда как лабораторный контроль отдаленных проявлений гипоспленизма является трудной задачей и мог бы явиться темой дальнейших исследований при подтверждении исходной концепции.

На первом этапе предстояло решить задачу выделения, культивирования и криоконсервации клеток свиной селезенки, т.е. разработать технологию, потенциально применимую в клинической практике. В качестве доноров использованы новорожденные поросята породы «Белая русская». Новорожденных свиней тщательно оберегали от кормления с целью исключить антигенную стимуляцию и получения иммуноглобулинов с молоком свиноматки [103].

Использованы три методики выделения клеток селезенки, в том числе, с применением механической дезагрегации по В.В. Малайцеву (1977) [84], с трипсинизацией ткани селезенки по методике Г.П. Советовой и соавт. (1976) [114] и с помощью комбинированного метода дезагрегации ткани, предложенного M. Berry (1969) [159] и разработанного С.А. Лепеховой (1999) для получения клеток эмбриональной свиной печени [78].

Оказалось, что механическая дезагрегация ткани селезенки, как и обработка трипсином (неспецифический протеолитический фермент [74]) обеспечивают низкий выход клеточного материала с низким удельным весом жизнеспособных клеток. В этой связи для получения изолированных клеток селезенки нами адаптирована методика комбинированной дезагрегации ткани, обеспечившая получение 5,86-6,40 х 10⁷ клеток из 1 г селезенки с показателем жизнеспособности 98,9-100%. При цитологическом исследовании в клеточной суспензии обнаруживали изолированные лимфоциты, макрофаги, моноциты и ретикулярные клетки. Иногда клетки располагались группами по 2-4.

В следующей серии экспериментов in vitro нами была проведена оптимизация рН культуральной среды, поскольку, как было показано в исследовании С.А. Лепеховой (1999), культивирование клеток в среде со стандартным рН 7,2 приводит к закономерному закислению среды и снижению количества жизнеспособных клеток [78].

В этой связи мы исследовали жизнеспособность культуры клеток и рН среды после 2 часов инкубации в термостате с температурой 37⁰С при исходном рН среды от 6,8 до 8,2. Оказалось, что при рН 7,6 процент жизнеспособных клеток наиболее высоким - 99,4% (99,4-99,6). На этом основании в среду для культивации, приготовленную по оригинальной прописи, добавляли NaOH, титрованием добиваясь повышения рН до 7,6.

В анализированной литературе нам не встретилось информации о результатах культивирования клеток селезенки в зависимости от сроков. В связи с этим мы ориентировались на известные данные S. Naik et al. (1996) и С.А. Лепеховой (1999) о пролиферативной активности клеток печени, достигающей в культуре максимума к 5-м суткам [78,261]

В процессе культивирования проводили трехкратную смену питательной среды с диспергированием клеточной взвеси, что снижает иммуногенность [74].

Отметим, что увеличение клеточной массы в полтора раза, зарегистрированное на пятые сутки культивирования, сопровождалось появлением ассоциаций лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Если при микроскопии суспензии выделенных клеток ассоциации встречались лишь в 5%, то после культивирования они доминировали. Это, вероятно, отражает возникающую в культуре межклеточную кооперацию и может быть связано либо с объединением клеток в культуральной среде либо с их делением к 5-м суткам. Кроме того, нами констатировано отсутствие апоптозных тел и сегментоядерных лейкоцитов в клеточной культуре.

Поскольку большая часть клеточной массы была представлена лимфоцитами, представляла интерес динамика содержания Т- и В- клеток в суспензии после выделения и культивирования. Использована реакция розеткообразования свиных лимфоцитов с эритроцитами барана и мыши, поскольку известна гомологичность аминокислотного состава некоторых классов лимфоцитов млекопитающих на 73-83% [291,363].

Установлено, что в процессе культивирования статистически значимо снижается содержание клеток, образующих розетки с эритроцитами барана (30,5% против 38,0; p_U=0,04) и мыши (19,0% против 23,0%; p_U=0,02). Если принять во внимание, что абсолютное количество клеток при этом увеличивается на 50%, можно предположить, что в культуре происходит пролиферация клеток нелимфоидного ряда, либо в процессе культивирования лимфоциты теряют (а вновь образованные не приобретают) соответствующие рецепторы.

Поскольку длительная криоконсервация была непременным условием, поставленном в исследовании, нами была разработана соответствующая среда, в которой в качестве внеклеточного консерванта был использован поливинилпирролидон (заявка на изобретение «Среда для консервации клеток селезенки»; приоритетная справка № 2001101802 \ 20 (001594) от 18.01.2001). Основные компоненты модифицированной нами среды ранее были с успехом апробированы С.А. Лепеховой (1999) для криоконсервации культуры эмбриональных клеток печени [78], а ее рН составлял 7,6 по результатам серии экспериментов, обсужденной выше. В качестве контроля использована среда, предложенная Ю.М. Зарецкой и соавт. (1978) для криоконсервации лимфоидных клеток [54]. В ней содержится внутриклеточный консервант – диметилсульфоксид, что требует его элиминации из суспензии после деконсервации материала [54,69].

Сравнительную оценку жизнеспособности клеток (изолированных и культивированных) после криоконсервации проводили в режимах «заморозка-оттаивание», а также после 3 и 6 месяцев хранения при температуре –70⁰С, рекомендованной в литературных источниках [69]. Оказалось, что относительное количество жизнеспособных клеток существенно снижается уже при кратковременном охлаждении материала в среде Зарецкой (70,2-70,7% против 99,2% в исходных образцах; p_U<0,05) и не имеет существенных различий с исходным показателем при использовании разработанной нами среды даже при 6-месячном хранении.(98,2% против 99,2%). Эти результаты позволяют нам рассчитывать на возможность создания банка клеток.

При исследовании процентного соотношения РОК в деконсервированном материале выявлено, что после 3-месячной криоконсервации происходит существенное снижение Е-РОК в некультивированном материале и менее выраженное – в культивированном, где относительное количество Т-лимфоцитов оказывается статистически значимо выше (26,0% и 29,5% соответственно; p_U<0,05). В отношении В-лимфоцитов криоконсервация приводит к однотипным изменениям, которые заключаются в существенном снижении фракции этих клеток (15,0% и 11,5%).

Для уточнения природы РОК в дальнейшем, безусловно, понадобится исследование с моноклональными антителами. Однако в настоящее время, по информации представителя фирмы DACO Karen Atwood (из переписки) таких наборов для свиных лимфоцитов не существует для коммерческого распространения.

Таким образом, в инициальной части исследования была разработана методика выделения клеток селезенки (лимфоцитов, макрофагов и ретикулярных клеток) новорожденных свиней и апробированы рациональные режимы их культивирования и криоконсервации.

Технология приготовления препарата для КТ была стандартной. Количество клеток – 2х10⁶ в 1 мл взвеси (приблизительно, 8-10х10⁶ на 1 кг массы тела) определено в соответствии с результатами работы С.А. Лепеховой, получивший выраженный терапевтический эффект от пересадки крысам с острой печеночной недостаточностью культуры эмбриональных клеток печени [78].

Зона и способ введения (под кожу брюшной стенки) были такими, чтобы, во-первых, увеличить площадь контакта ксеногенного материала с тканями реципиента, а во-вторых, максимально облегчить последующее морфологическое исследование зоны трансплантации.

Обсуждая результаты исследования на животных, прежде остановимся на принципах формирования экспериментальных групп. Использована апробированная ранее в серии исследований, проведенных в клинике, модель СПГ, вызванного полной аспленизацией крыс (удаление всей селезенки и эктопированных очагов ее ткани) [10,11]

В соответствии с исходной гипотезой исследования были введены 2 основных группы: животные, получившие КТ ККС (ОГ-1) и КТ ИКС (ОГ-2). Необходимость оценки эффектов КТ ИКС была обусловлена характерными сдвигами клеточного состава в процессе культивации, обсужденными выше. Контролем послужили крысы с экстраперитонеальной АТС (КГ-1) – для сравнения морфо-функциональных результатов трансплантации аутологичной и ксеногенной ткани; с инъекцией 1 мл среды для криоконсервации (КГ-2) – для исключения фармакологических эффектов ингредиентов среды; ложнооперированные (КГ-3). Ранее было показано, что ЭП АТС менее эффективна, чем сохранение части селезенки с магистральным кровоснабжением in situ, но смягчает патогенные эффекты спленэктомии [43].

Мы не рассматривали эффектов пересадки свежевыделенных клеток или культивированных и тотчас пересаженных, поскольку криоконсервация представляется непременным условием формирования банка тканей, необходимого в клинической практике.

В первой серии экспериментов оценивали летальность на протяжении 21 суток после СЭ с трансплантацией ткани селезенки. Сроки исследования были выбраны согласно известным представлениям о завершении регенераторных процессов в аутотрансплантате селезенки у крысы [8,279].

Введенные в эксперимент контрольные группы позволили выделить патогенные эффекты аспленизации: если среди ложнооперированных животных летальности не было вовсе, то развивающиеся проявления некорригированного СПГ привели к 100% гибели крыс на протяжении 15 суток после операции. Тот факт, что во всех группах гибель животных наблюдали лишь с 5-х суток после вмешательства на селезенке, позволяет предположить, что на протяжении первых суток послеоперационного периода не происходит критического снижения антимикробной резистентности организма, а в дальнейшем развивается истощение компенсаторных резервов, обусловленное индуцированным гипоспленизмом.

КТ ИКС оказалась настолько же эффективной для снижения летальности, что и АТС (существенные различия показателя по сравнению с группой аспленизированных и ложнооперированных без внутригрупповых различий на протяжении всего эксперимента). В то же время КТ ККС на 8-е сутки эксперимента способствовала статистически значимому снижению летальности по сравнению с животными, получившими КТ ИКС и АТС. Следовательно, в процессе культивирования клетки селезенки новорожденной свиньи приобретают выраженные саногенные свойства, что можно объяснить выработкой биологически активных веществ и цитокинов, накапливающихся в культуральной среде. Резорбция этих продуктов клеточной жизнедеятельности после КТ ККС, вероятно, лежит и в основе отсроченной гибели животных по сравнению с получившими КТ ИКС и АТС (первые крысы в ОГ-1 погибли на 7-е сутки эксперимента а в двух других группах – на 5-6-е сутки). Кроме того, СЭ приводит к максимальной гибели животных на 7-е и 9-е сутки, а КТ ККС предотвращает эти пики летальности, в отличие от КТ ИКС, которая не предупреждает летальности на 7 сутки. На этой основе можно предположить, что в ККС содержатся саногенные вещества, вероятно, накопленные в процессе культивирования, а взвесь ИКС лишена этих продуктов.

На 21 сутки (время полной регенерации аутотрансплантата по D. Perla (1936) все методы коррекции СПГ одинаково эффективны, поскольку нет значимых различий в летальности после КТ и АТС.

При патоморфологическом исследовании печени и легких животных, погибших на 5-6, 7-8 и 9-15 сутки эксперимента, установлены однотипные закономерности, заключающиеся в смене приоритетности органных повреждений. Если на 5-6-е сутки после индукции гипоспленизма у погибших крыс преобладали некротические и воспалительные процессы в печени, максимально выраженные в перипортальных зонах, а воспалительные изменения легочной ткани были минимальными, то у погибших на 9-15-е сутки доминировали деструктивные процессы в легких (абсцедирующая пневмония, вызванная кокковой флорой), а изменения в печени были существенно менее выраженными, чем у погибших на 5-6 сутки. Это позволяет предположить, что в патогенезе постспленэктомического гипоспленизма наблюдается стадийность поражения органов системы фагоцитирующих мононуклеаров с первоначальной локализацией в печени и последующим распространением на ткань легкого. Причиной этого явления может явиться бактериальная транслокация микрофлоры из полости кишечника, которая присутствует в норме и закономерно усиливается после хирургических вмешательств на органах живота [94].

Мы предположили, что в условиях гипоспленизма развиваются аналогичные изменения проницаемости кишечной стенки для микрофлоры с ее портальным распространением. КТ ККС, согласно полученным данным, ограничивает повреждения печени у погибших на 7-8-е сутки животных по сравнению с аспленизированными, у которых удалось четко проследить снижение степени перипортальных повреждений печеночной паренхимы от 5-6-х суток к 9-15-м. КТ ИКС оказалась в этом плане менее эффективной, однако, и ККС и ИКС способствуют снижению степени повреждений легочной паренхимы, которая отчетливо прослеживается к 9-15-м суткам у погибших аспленизированных животных и проявляется существенным снижением летальности у животных с КТ на 9-15 сутки.

Предполагаемые механизмы, вероятно, связаны с продукцией введенными клетками селезенки новорожденной свиньи факторов роста, выработка которых в спленоцитах описана [312]. Известно, что факторы роста препятствуют бактериальной транслокации за счет повышения регенерации кишечного эпителия [215,289,358]. Этим гипотетическим механизмом, вероятно, можно объяснить саногенные эффекты ККС и ИКС.

АТС не приводит к существенному изменению морфологических нарушений в печени и легких, что согласуется с данными, согласно которым выработка факторов роста в зрелых клетках существенно уменьшается [289].

Если бактериальная транслокация играет существенную роль в патогенезе СПГ, то логичным было бы предположить преобладание в очагах деструкции кишечной палочковой флоры, которая, как известно, раньше перемещается через кишечный барьер [94]. Но в наших наблюдениях пневмония была вызвана кокковой, а не палочковой флорой, как установлено при бактериоскопии. Это становится объяснимым, если учесть, что грамположительные анаэробы (в т.ч. кокки) также обладают способностью к бактериальной транслокации [94]. Кроме того, известно, что в отношении кокков, наделенных полисахаридной капсулой, более всего выражено снижение фагоцитарной активности после СЭ [204,294], что связывают с приобретенной недостаточностью тафцина [262,364].

Интересными и во многом неожиданными представляются результаты морфометрии печени, проведенной на 14-е и 21-е сутки эксперимента у выживших животных. Так, КТ ККС вызывает существенное увеличение к 21-м суткам по сравнению с 14-ми количества гепатоцитов (вероятно, за счет выработки ксеногенными клетками факторов роста, прежде всего, фактора роста гепатоцитов). А КТ ИКС не сопровождается подобным эффектом, а наоборот, связано со снижением количества гепатоцитов к 21-м суткам, по сравнению с нормой.

Количество эндотелиоцитов и клеток Купфера, существенно повышенное на 14 сутки после трансплантации селезенки в любом варианте (КТ ККС и ИКС, АТС) заставляет предположить, что регенерация перенесенного материала способствует этому увеличению, вероятно, за счет воздействия специфических цитокинов. К 21-м суткам их количество недостоверно увеличивается после КТ ККС и не существенно снижается при КТ ИКС и АТС, что может свидетельствовать о пролонгированной продукции специфических факторов роста введенной культурой клеток селезенки. Это подтверждается и при суммарной оценке количества непаренхиматозных клеток печени, которое после КТ ККС существенно выше нормы на 14-е сутки и достоверно увеличивается к 21-м суткам. При КТ ИКС и АТС также наблюдается увеличение общего количества непаренхиматозных клеток печени от 14-х к 21-м суткам, но эти изменения менее выражены, чем при трансплантации культуры клеток селезенки.

Особый интерес представляет анализ количества клеток Купфера, фагоцитирующих эритроциты. Если на 14-е сутки их количество не отличается от нормы у крыс с ксенотрансплантацией клеток селезенки и аутоспленотрансплантацией, то на 21-е сутки этот показатель снижается под воздействием КТ ККС и при АТС, а при КТ ИКС, наоборот, увеличивается. По нашему мнению, снижение эритрофагоцитоза в печени свидетельствует о развитии спленоидных структур, выполняющих функции эритрофагоцитоза, либо о стимуляции этой функции в других специализированных отделах системы фагоцитирующих мононуклеаров. Нельзя исключить, что реализация этого процесса также связана с эффектами неких цитокинов.

Что касается лимфоцитарной инфильтрации портальных трактов, при КТ ККС она не отличается от нормальных величин на 14-е сутки, и увеличивается в гораздо меньшей степени, чем при трансплантации ИКС и АТС к 21-м суткам. Вероятно, этот эффект можно объяснить воздействием факторов роста, вырабатываемых культурой клеток на кишечный эпителий, что как известно, уменьшает бактериальную транслокацию микроорганизмов из полости кишечника в портальную систему [256,318,358].

Таким образом, КТ ККС является эффективным способом профилактики гипоспленических нарушений, связанных с повреждением печени, которые, в свою очередь, вероятно, связаны с увеличением бактериальной транслокации патогенов из полости кишечника в портальное русло.

Исследование структуры легких у гипоспленических животных под влиянием трансплантации ткани селезенки также свидетельствовало в пользу стадийности повреждения легочного фильтра, разнонаправленной с патологическими процессами в печени. КТ ККС и ИКС, АТС ограничивают воспалительные изменения в легких, выраженные у аспленизированных крыс на 7-е сутки (в ложнооперированном контроле они выражены минимально). В дальнейшем (14-21-е сутки) легочное воспаление прогрессирует при КТ ИКС и АТС и достигает максимума к 21-м суткам. В то же время КТ ККС сопровождается некоторым снижением легочного воспаления к последнему сроку исследования (количественная балльная оценка, как и при ЛО). Можно предположить, что эффективная стимуляция репаративных процессов в печени под влиянием КТ ККС вызывает закономерное снижение повреждения легочного фильтра. Эти явления также могут быть связанными с прямой стимуляцией репаративных процессов в легочной паренхиме за счет факторов, продуцируемых в селезеночной культуре клеток. Сравнительный анализ воспалительных изменений в легких подтверждает более высокий эффект КТ ККС по сравнению с КТ ИКС и АТС.

Оценку структуры трансплантата мы считали целесообразной с позиций классических представлений о регенерации аутологичных фрагментов селезенки при ее гетеротопическоцй аутотрансплантации [279]

Характерными проявлениями регенерации селезеночной аутоткани является инициальный некроз трансплантата с ранним прорастанием капилляров из окружающих тканей от периферии к центру перенесенных фрагментов. Впоследствии развиваются ретикулярные структуры (центрипетальная регенерация) с компонентами белой пульпы. Морфология регенерирующей селезенки при свободной экстраперитонеальной аутотрансплантации была описана О.А. Гольдбергом и К.А. Апарциным [11].

В этой связи крысы с аутоспленотрансплантацией рассматривались в качестве контроля (КГ-2). Наши результаты свидетельствуют, что ранние процессы регенерации ксеногенных (свиных) клеток селезенки в подкожной основе крысы развивается по закономерностям, характерным для ЭП АТС. На 7-е сутки и ксеногенный, и аутологичный материал был представлен центральной зоной некроза с новообразованными капиллярами по периферии и связанной с ними краевой зоной пролиферации с наличием фибробластов, лимфоцитов и макрофагов. Таким образом, на 7-е сутки после трансплантации обнаруживали характерную морфологию «селезеночных телец» (эквивалент красной пульпы селезенки). Морфологические находки при КТ культивированных и изолированных клеток ксеноселезенки на 7-е сутки были одинаковыми.

На 14-е сутки эксперимента появлялись различия в структуре ксенотрансплантатов: культивированные клетки селезенки давали начало структурам, более напоминающим элементы красной пульпы с явлениями эритрофагоцитоза. Что касается изолированных клеток селезенки, их регенерация приводила к развитию структур с морфологией, соответствующей строению лимфоузла с нечетким делением на зоны. Аутотрансплантат в это время представлен типичными «селезеночными тельцами» с преобладанием элементов красной пульпы. К 21-м суткам макро- и микроскопически перенесенная ксеногенная ткань имела одинаковые характеристики при ксенотрансплантации ККС и ИКС: уплощенные светло-розовые образования вытянутой формы, ориентированные по ходу инъекционной иглы, со структурой, соответствующей лимфоузлу. В них выявлены участки пролиферации ретикулярных клеток синусов и субкапсулярно расположенные зоны скопления плазмобластов и, в меньшей степени, плазмоцитов. Дифференцировать структурные особенности на светооптическом уровне не представилось возможным. Принципиально важно, что ни в одном наблюдении нам не встретилось морфологических признаков реакции «трансплантат против хозяина» и «хозяин против трансплантата», что свидетельствует о низкой иммуногенности ткани селезенки новорожденных поросят, хотя селезеночные клетки по данным литературы обладают максимальной иммуногенностью [14]. Это дает основания предполагать низкую иммунную реактивность при введении препарата человеку.

Обсуждая количество перенесенной ткани и вызванные ею эффекты, подчеркнем, что объем препарата для ксенотрансплантации (1,0 мл) был существенно больше, чем при аутотрансплантации (0,3 мл). Мы не проводили специального подсчета количества клеток в перенесенной аутоткани, поскольку объемы селезенки для ксено- и аутотрасплантации определялись известными литературными данными. Кроме того, в данной работе мы не стремились оценить эффекты дозозависимости.

Полученные данные о саногенных эффектах КТ ККС послужили основанием для сравнительной оценки показателей кожной ранотензиометрии. Известно, что сила натяжения заживающих ран объективно отражает функции фибропластического процесса [51,105], а при СЭ синтез фибробластов и коллагена нарушается, что ухудшает течение раневого процесса [347].

Мы предположили, что повышенная регенерация паренхиматозных и непаренхиатозных клеточных пулов печени под влиянием КТ ККС обусловлена воздействием факторов роста, продуцируемыми ксеногенными клетками. В серии экспериментов с ранотензиотерией, проведенной на 7 сутки (заживление кожной раны после лапаротомии у всех использованных животных было только первичным натяжением), мы показали, что прочность раны существенно повышается под влиянием ККС и не отличается после этой процедуры от нормальных величин, определенных у ложнооперированных крыс. С другой стороны, ни КТ ИКС, ни АТС не повышали прочность раны на 7-е сутки после операции. Этот факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой в процессе культивирования клеток селезенки новорожденной свиньи создаются оптимальные условия для продукции регуляторных пептидов, либо они накапливаются в культуральной среде. Такая концепция согласуется с мнением N. Werbin (1983), предположившего на основании изучения раневого процесса у спленэктомированных крыс, что факторы, вырабатываемые в селезенке, влияют прямо или косвенно на синтез фибробластов и коллагена и, таким образом, на прочность раны [51,105,347].

На основе представленных данных нами были оценены некоторые лабораторные параметры гомеостаза под влиянием трансплантации ткани селезенки; эти результаты вошли в последнюю главу собственных наблюдений.

Обсуждая влияние трансплантации ткани селезенки на процессы цитолиза в печени, обратимся к результатам сравнительного анализа уровней АсАТ/АлАт и ЛАП в динамике эксперимента. Правомочность сравнительного исследования активности аминотрансфераз для характеристики поражения гепатоцитов подтверждается тем, что коэффициент де Ритиса во всех наблюдениях превышал 1,33 [93].

Оказалось, что КТ ККС предотвращает развитие цитолитических процессов в печени, в то же время после КТ ИКС, АТС и полной аспленизации уровень АсАТ был существенно выше нормы с постепенным снижением к 21-м суткам, более выраженным у животных с АТС. Уровень ЛАП (показатель повреждения эпителия билиарного тракта) существенно снижался после АТС, не имел отличий от нормальных показателей после КТ ККС и повышался после КТ ИКС на 7-е сутки после операции. В дальнейшем происходило повышение активности фермента и под влиянием АТС (14-е, 21-е сутки) при нормальных величинах на фоне введения ККС. Можно предположить, что регенерирующие ИКС и ткань АТС становятся продуцентами факторов, стимулирующих регенерацию эпителия желчных ходов, тогда как ККС лишена этого свойства. В целом при оценке цитолитических процессов в печени установлено мощное протекторное действие ККС.

Сравнительный анализ показателей белково-синтетической функции печени выявил стимулирующий эффект КТ ККС по сравнению с другими вариантами коррекции. Это выражалось в повышении уровней сывороточной ХЭ и фракции альбумина на 14-е сутки эксперимента, более выраженном, чем в других группах животных со спленэктомией. Вопреки ожиданиям, концентрация общего белка сыворотки крови после КТ ККС достигала максимальных значений не на 14-е, а на 21-е сутки эксперимента, когда уровень альбумина снижался, оставаясь на гипернормальных значениях. Можно было предположить, что это связано с развивающейся иммунной реакцией на чужеродную ткань с соответствующим повышением уровня фракции γ-глобулинов.

Как было установлено при сравнительном анализе спектра глобулинов сыворотки крови, в нем отсутствовали изменения, характерные для развития аутоиммунного процесса и характеризующиеся повышением удельного веса фракции γ -глобулинов. Кроме того, фракции α₁-, α₂- и β-глобулинов под влиянием КТ ККС нормализовались на 21-е сутки эксперимента и не отличались от показателей, зарегистрированных у ложнооперированных животных. В то же время наблюдались закономерные отличия белкового спектра у крыс, получивших КТ ИКС либо АТС. Таким образом, КТ ткани селезенки, согласно полученным данным, не вызывает острой воспалительной или иммунной реакции, что подтверждает морфологические данные, обсужденные ранее.

Если реакция гуморального звена иммунитета в ответ на КТ оказалась невыраженной, то необходимо было охарактеризовать клеточный иммунный ответ. С этой целью, а также для оценки системной воспалительной реакции на индуцированный гипоспленизм, корригированный спленотрансплантацией, был проведен сравнительный анализ уровня лейкоцитов и формулы периферической крови.

При исследовании лейкоцитоза венозной крови оказалось, что максимальными проявления системной воспалительной реакции были у аспленизированных животных, а КТ ККС и ИКС снижала уровень лейкоцитов более эффективно, чем АТС. Следовательно, КТ селезенки купирует проявления системной воспалительной реакции (ее возможной причиной является бактериальная транлокация патогенов, как мы сообщали выше). Уровень сегментоядерных нейтрофилов под влиянием КТ ККС и АТС приходит к норме на 21-е сутки, а КТ ИКС ведет к снижению этого показателя по сравнению с нормой. В то же время количество моноцитов в мазке крови нормализуется при КТ ККС и ЛО на 21-е сутки исследования, в то время как у животных с КТ ИКС и АТС эти показатели повышены. Ни в одной группе нами не обнаружено существенного повышения уровня лимфоцитов, по сравнению с нормой, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии Т-клеточной реакции на ксенотрансплантацию.

Описанные изменения лейкоцитарной формулы крови (снижение количества сегментоядерных нейтрофилов с одновременным увеличением относительного количества моноцитов) могли свидетельствовать об изменении (скорее всего, снижении) неспецифической резистентности организма у гипоспленических животных под влиянием КТ ИКС и АТС. Для проверки этой гипотезы проведены исследования показателей фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов, которая, как известно закономерно снижается после аспленизации [37,227,234].

Выраженный иммунодефицит у спленэктомированных животных сопровождался депресссией фагоцитарной активности и снижением фагоцитарного числа. КТ клеток селезенки (особенно ИКС), а также АТС способствовали некоторому повышению фагоцитарной активности, достигающей максимума на 14-е сутки эксперимента с последующей нормализацией этого показателя. Поглотительная способность нейтрофилов не уменьшалась по сравнению с ложнооперированным контролем и нормой лишь у животных с КТ ККС, а, напротив, существенно возрастала к 21-м суткам. Эти данные свидетельствуют об активации фагоцитоза под воздействием КТ ККС, которая также повышает функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитирующих клеток, как установлено в серии определений активированного (индуцированного) теста с НСТ. Таким образом, нами получено подтверждение активирующего влияния КТ ККС на фагоцитоз. Мы отказались от определения фракций иммуноглобулинов и клеточных субпопуляций лимфоцитов, поскольку в предыдущих исследованиях на крысах, выполненных в нашей клинике [12], было показано отсутствие закономерностей изменений этих показателей у аспленизированных животных по сравнению с получившими АТС или органосохраняющие операции на селезенке.

Оценка количества эритроцитов венозной крови была предпринята нами в связи с тем, что у всех животных после удаления селезенки обнаруживали признаки анемии. Подчеркнем, что при аутопсии ни разу не было внутрибрюшинного кровотечения. Следовательно, анемия, которая развивалась после удаления селезенки и отсутствовала у ложнооперированных животных (у последних развивалось некоторое сгущение крови вследствие отказа от воды и пищи в раннем послеоперационном периоде), была обусловлена спленэктомией. КТ ККС сопровождается наименьшей выраженностью анемии по сравнению с животными с КТ ИКС, АТС и СЭ. В дальнейшем происходит постепенное увеличение количества эритроцитов в крови крыс, получивших трансплантацию, но анемия сохраняется. Оказалось, что после ЛО анемия (статистически значимое снижение уровня эритроцитов по сравнению с нормой) также развивается к 21-м суткам эксперимента. При этом количество эритроцитов в крови животных с КТ ККС и ложнооперированных не различалось. Можно предположить, что коррекция анемии, более эффективная при КТ ККС, имеет своей основой воздействие эритропоэтических факторов, стимулирующих костномозговое кроветворение. Анемия становится объяснимой с учетом важной роли селезенки, как регулятора эритропоэза у крыс [38,45], следовательно, коррекция анемии под воздействием КТ ККС является критерием эффективности лечения гипоспленизма. Это подтверждается появлением незрелых форм эритроцитов в крови аспленизированных животных, получивших КТ, уже с 7-х суток, с их исчезновением к 21-м суткам эксперимента (такой же эффект отмечен на 14-е сутки при АТС). Появление патологических эритроцитарных включений в крови мы склонны рассматривать, скорее, не как признак раннего гипоспленизма, а как проявление интенсивного кроветворения: это явление наблюдали лишь после КТ ККС на 14-е сутки. Выраженные сдвиги в картине красной крови послужили основанием для сравнительного анализа гематокрита и некоторых показателей коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза под влиянием трансплантации ткани селезенки.

Сдвиги, обнаруженные при сравнительном анализе гематокрита соответствовали, в целом, изменениям, обнаруженным со стороны эритроцитов. Отметим, что после КТ ККС на 21-е сутки показатель соответствовал норме, а КТ ИКС и АТС не обеспечивали такого эффекта. Вязкость крови также нормализовалась под влиянием пересадки ККС и при АТС, но после КТ ИКС оставалась низкой на всем протяжении эксперимента. Гиперфибриногенемия, в наибольшей степени выраженная животных после СЭ и после КТ ККС, вероятно, имела разные механизмы происхождения. Если в аспленизированном контроле она являлась характерным проявлением системной воспалительной реакции, то при КТ ККС повышение уровня фибриногена может быть связано с активацией белково-синтетической функции печени, показанной нами ранее. Впоследствии происходила нормализация этого показателя под воздействием ККС. Установлено, что аспленизация приводит к выраженному уменьшению протромбинового индекса, а на фоне трансплантации ткани селезенки (особенно КТ ККС), наоборот, этот показатель существенно увеличивается на 7-е сутки с последующей нормализацией к 21-м суткам. Такие же изменения происходили и в системе тромбоцитарно-сосудистого гемостаза, судя по ориентировочному показателю (агрегация тромбоцитов). Впрочем, мы не проводили детального исследования этого звена свертывающей системы крови, а акцентировали внимание на гуморальных факторах (коагуляционный гемостаз). Анализ времени свертывания крови позволил установить, что повышенное содержание факторов коагуляционного гемостаза сопровождается при ККС не гипер-, а наоборот, гипокоагуляцией. Объяснить этот факт, вероятно, можно повышением уровня гепарина и/или каких-либо других естественных антикоагулянтов, например антитромбина-III, тафцина. Мы не исследовали углубленно этого феномена, поскольку основной задачей являлось выяснить, какие параметры гомеостаза в наибольшей степени отличаются от нормы у гипоспленических животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки.

Патогенные влияния, обусловленные СПГ, и саногенные эффекты трансплантации ткани селезенки, выявленные в нашем исследовании, систематизированы в табл. 6.1.

При обработке результатов проведенного исследования мы постоянно сталкивались с ограничивающим патогенное воздействие аспленизации и стимулирующим эффектом пересадки культуры клеток ксеногенной селезенки. Полученные данные согласуются с результатами работы С.А. Лепеховой (1999), изучавшей результаты КТ культуры эмбриональных клеток свиной печени при остром токсическом повреждении печени крыс четыреххлористым углеродом. Было показано, что воздействие подкожной ксенотрансплантации культуры, содержащей ассоциации гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени, совпадает с эффектами фактора роста гепатоцитов [208,210].

Результаты нашего исследования показывают, что введение культуры, содержащей ассоциации клеток стромы, лимфоцитов и макрофагов более эффективно, чем трансплантация изолированных клеток свиной селезенки.

Таблица 6.1

Эффекты спленотрансплантации у животных с индуцированным постспленэктомическим гипоспленизмом

Эффекты	КТ ККС	КТ ИКС	АТС	СЭ	ЛО
Летальность	+	++	++	+++	0
Этапное воспалительное поражение печени и легких у погибших животных (световая микроскопия)	+	+	+	+	0
Инфильтрация портальных трактов (морфометрия)	+	++	++	Н.д.	+
Воспалительные изменения в легких (световая микроскопия)	+	++	++	+++	+
Проявления системного воспалительного ответа (общий анализ крови)	+	++	++	+++	0
Воспалительные фракции белков; α-глобулины (электрофорез)	+	++	+	+++	+
Количество гепатоцитов (морфометрия)	++	+	+	Н.д.	+
Количество непаренхиматозных клеток печени (морфометрия)	++	+	+	Н.д.	0
Эритрофагоцитоз в печени (морфометрия)	+	++	+	Н.д.	+
Цитолитический синдром (биохимические тесты)	+	++	++	++	0
Белково-синтетическая функция печени (биохимические тесты)	++	+	++	-	+
Иммуноглобулины (электрофорез)	+	+	++	+	+
Стимуляция эритропоэза после СЭ (общий анализ крови)	++	+	+	-	0
Механическая прочность кожной раны (ранотензиометрия)	++	+	+	+	++
Неспецифическая резистентность (показатели фагоцитоза нейтрофилов)	+++	+++	++	+	+++
Коагуляционный гемостаз	++	+	+	+	+
Время свертывания крови	++	+	+	+	+

Для того, чтобы уточнить предполагаемый спектр цитокинов, обладающих активностью в отношении исследованных нами процессов, был проведен дополнительный информационный поиск, выходящий за рамки исходной концепции. Соотносили данные литературы с эффектами, зарегистрированными в наших экспериментах – табл. 6.2.

Как видно из таблицы, существует целый спектр полипептидов – цитокинов, именуемых факторами роста, эффекты которых аналогичны документированным в нашем исследовании. Продуцентами регуляторных пептидов в клеточном материале селезенки новорожденных поросят могут явиться разнообразные клетки – от ретикулярных до лимфоидных и макрофагов. Данные, представленные в табл. 6.2, заставляют предположить, что в культуре клеток содержится не один, а несколько таких цитокинов, комплексным воздействием которых при трансплантации обусловлены эффекты КТ ККС. Отсюда понятно, почему эффективность КТ ИКС ниже – выработка факторов роста начинается лишь после введения материала реципиенту. Если саногенное воздействие обусловлено этими веществами, тогда всплеск метаболической активности печени, зарегистрированный на 14-е сутки после КТ ККС обусловлен их продукцией в ретикулярных структурах селезенки («селезеночные тельца»), которые к 21-м суткам замещаются лимфоидной тканью, что сопровождается нормализацией показателей гомеостаза.

Таким образом, в раннем послеоперационном периоде КТ клеток свиной селезенки, особенно после 5-суточной культивации, обеспечивает коррекцию гипоспленических нарушений. Трехмесячная криоконсервация несущественно влияет на жизнеспособность культуры клеток. Саногенные эффекты, вероятно, обусловлены продукцией факторов роста пересаженной тканью. Известна тесная взаимосвязь между системами, реализующими иммуногенез, гемостаз и неспецифическую резистентность организма [73]. Нормализация параметров, нарушенных в результате аспленизации, путем КТ подтверждает исходную гипотезу исследования. Эти результаты, по нашему мнению, могут явиться предпосылкой для клинического применения разработанной технологии в ситуациях, когда спленэктомия является вынужденным маневром и не сопровождается аутоспленотрансплантацией.

выводы

1. Разработанная методика получения изолированных и культивированных клеток селезенки новорожденной свиньи позволяет получать материал с содержанием клеток 2,1 х10⁷ в 1 мл и высоким показателем жизнеспособности (98,5-98,9%) после трехмесячной криоконсервации.

2. Ксенотрансплантация культуры клеток селезенки способствует существенному снижению летальности на 8-е сутки после аспленизации по сравнению с пересадкой изолированных клеток ксеногенной селезенки и аутоспленотрансплантацией. Каждый из этих способов обеспечивает статистически значимое снижение летальности в условиях постспленэктомического гипоспленизма.

3. Воспалительные изменения в легких у аспленизированных крыс возникают в более поздние сроки, чем поражение печени. Подкожное введение культуры клеток свиной селезенки приводит к увеличению количества гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени и ограничивает легочный воспалительный процесс.

4. Ксенотрансплантация культуры клеток селезенки сопровождается существенным увеличением механической прочности кожной раны на модели постспленэктомического гипоспленизма.

5. Эффектами ксенотрансплантации культуры клеток селезенки является повышение белковосинтетической функции печени и снижение выраженности цитолитического синдрома у аспленизированных крыс.

6. Пересадка клеток селезенки свиньи приводит к нормализации неспецифической резистентности организма. Ксенотрансплантация культуры клеток селезенки стимулирует эритропоэз и активирует коагуляционное звено гемостаза при одновременном повышении времени свертывания крови.

7. Трансплантация культуры клеток свиной селезенки сопровождается лучшими морфо-функциональными результатами, чем пересадка изолированных клеток селезенки аспленизированным крысам.