3.2.Консервация клеток

Сохранение клеток селезенки (выделенных из селезенки или после пятисуточного культивирования) проводили при –70⁰С, что соответствует современным рекомендациям. Криоконсервации подвергали материал, содержащий различные типы клеток, поэтому важным этапом явилось создание соответствующей среды. Рассмотрим эти результаты.

3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации

Нашей задачей являлась разработка среды, обеспечивающей высокую жизнеспособность при длительном хранении в замороженном состоянии всех клеток селезенки - как лимфоцитов, так и макрофагов, моноцитов, ретикулярных клеток.

Эту задачу удалось решить применением среды в оригинальной прописи (приоритетная справка на изобретение «Среда для консервации клеток селезенки» №2001101802/20 (001594)), содержащей в качестве криоконсерванта экзоцеллюлярный искусственный полимер поливилпирролидон. В качестве жизнеобеспечивающих компонентов среда дополнительно содержит питательную среду RPMI-1640, сыворотку эмбриональную телячью категории № К055, калия оротат, дексаметазон, липиды бобов сои без холестерина, рН=7,6, при следующем соотношении компонентов, мас. ч.:

Среда RPMI-1640- 10 - 10,5

Поливинилпирролидон 10 % 1 - 1,5

Сыворотка эмбриональная телячья кат. № К055 3 - 3,6

Калий оротат 1 - 1,2

Дексаметазон Е-6- 5,0 Е в 1 мл 0,1

Липиды бобов сои без холестерина-17 мкг/мл 1

рН=7,6.

Основой предлагаемой среды служит стандартная среда RPMI, которая является питательным субстратом при культивации клеток селезенки. Поливинилпирролидон является внеклеточным криоконсервантом, защищает клетки при замораживании и оттаивании, препятствуя их повреждению кристаллами льда, и не оказывает на них токсического влияния. Кроме этого, поливинилпирролидон обладает антитоксическим действием.

Стандартная сыворотка эмбриональная телячья кат. № К055 и липиды бобов сои являются питательной добавкой к среде криоконсервации, обеспечивающей высокую сохранность клеток селезенки.

Известно, что при замораживании клетки интенсивно теряют калий, что приводит к «свинчиванию» цитоплазмы и потери их жизнеспособности. Поэтому производили перенасыщение среды калием, достигаемое за счет введения калия оротата. Кроме этого, калия оротат препятствует клеточной адгезии при длительном хранении в замороженном состоянии. Указанный состав предлагаемой среды и условия хранения обеспечили высокую степень сохранности клеток после длительной, в течение 6 месяцев, криоконсервации. Оценку жизнеспособности консервированных клеток проводили с помощью теста «на исключение красителя».

Концентрация клеток селезенки при криоконсервации составила 2,1 (2,0-2,2) х10⁷ в 1 мл. Для экспериментальной проверки были проведены исследования на 36 образцах клеточной взвеси, приготовленной из селезенок поросят 1 дневного возраста. Сравнительные результаты криоконсервации с использованием разработанной среды и с применением среды Ю.М. Зарецкой и соавт. представлены в табл. 3.3.

Таблица 3.3

Жизнеспособность клеток после криоконсервации с применением различных сред (медиана, нижний и верхний квартили)

Среда для криоконсервации		Исходные показатели	Режим криоконсервации
			Заморозка-оттаивание	Хранение в течение
				3 мес.	6 мес.
Среда Зарецкой Ю.М.	1	99,2 (98,7-99,8) n=18	70,2 * ¨ (70,1-70,9) n=8	70,1 ¨ (69,5-70,7) n=4	70,2 ¨ (69,7-70,5) n=18
	2	99,3 (98,9-99,4) n=18	70,7 * ¨ (70,4-70,9) n=8	-	-
Разработанная среда	1	99,2 (98,7-99,8) n=18	98,9 (98,7-99,0) n=18	98,7 (98,4-98,8) n=18	98,5 (97,7-98,6) n=4
	2	99,3 (98,9-99,4) n=18	98,9 (98,7-99,0) n=10	98,7 (98,5-98,9) n=10	98,2 (97,8-98,5) n=7

Примечания: 1 – выделенные клетки селезенки без культивирования; 2 – клетки селезенки, культивированные в течение 5 суток; * - значимые различия (p_U<0,05) по сравнению с предыдущим показателем в группе; ¨- значимые различия (p_U<0,05) по сравнению c консервацией в разработанной среде

 

Таким образом, предложенная среда обеспечивает существенно более высокую жизнеспособность клеток селезенки при длительном (3 и 6 мес.) хранении в замороженном состоянии, при этом отсутствует слипание клеток, упрощается методика приготовления клеток к трансплантации, так как не требуется удаления среды криоконсервации и тем самым уменьшается клеточное повреждение.

Поскольку применение внутриклеточного консерванта диметилсульфоксида сопровождалось низкой жизнеспособностью деконсервированного материала, в дальнейшем мы отказались от использования среды Ю.М. Зарецкой и соавт.

Деконсервацию клеток, замороженных в разработанной среде, проводили по стандартной методике. Элиминацию среды криоконсервации не производили, так как ее компоненты были нетоксичными.

Цитологическое исследование деконсервированной суспензии выявило характерные закономерности. Так, изолированные клетки селезенки после размораживания были представлены группами клеток (лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, ретикулярных клеток) с четкими контурами относительно светлых ядер, четко определяемым ядрышком. У части малых и средних лимфоцитов просматривались ядерные отростки. Встречались отдельные сегментоядерные лейкоциты и апоптозные тела - рис.3.3.

Рис.3.3. Выделенные клетки селезенки после 3-х месячной криоконсервации. Окраска по Романовскому. Ув. 860.

В культуре клеток селезенки после размораживания клеточные конгломераты преобладали над разрозненными клетками. Лимфоциты были с плотным хроматином. По периферии конгломератов находились клетки с четкими контурами ядер, с 1-2 ядрышками. Апоптозные тела и сегментоядерные лейкоциты отсутствовали (рис. 3.4).

Рис.3.4. Культивированные клетки селезенки после трехмесячной криоконсервации. Окраска по Романовскому. Ув. 860.

 

Функциональное состояние фракции лимфоцитов в клеточной взвеси оценивали реакцией Е- и М- розеткообразования. Результаты тестов представлены в табл. 3.3.

Как видно из таблицы, до криоконсервации удельный вес Е-розеткообразующих лимфоцитов был статистически значимо выше в выделенной клеточной взвеси по сравнению с культивированными клетками (р_U=0,04). После криоконсервации выделенной клеточной взвеси содержание Е-РОК в ней существенно уменьшилось (р_U=0,04), а в культивированной клеточной взвеси значимо не изменилось.

Таблица 3.3

Влияние криоконсервации на способность лимфоцитов селезенки к реакции розеткообразования (медиана, нижний и верхний квартили)

		Е-РОК, %	М-РОК, %
До криоконсервации	1	38,0 (35,0-39,0)	23,0 (21,0-25,0)
	2	30,5 (30,0-32,0) ¨	19,0 (19,0-20,0) ¨
После криоконсервации в течение 3 мес.	1	26,0 (26,0-27,0) *	15,0 (15,0-15,0) *
	2	29,5 (29,0-30,0)	11,5 (10,0-13,0) * ¨

Примечания: 1 – выделенные клетки селезенки без культивирования; 2 – клетки селезенки, культивированные в течение 5 суток; * - значимые различия (p_U<0,05) покатазелей розеткообразования до и после криоконсервации; ¨ - значимые различия (p_U<0,05) показателя культивированных клеток по сравнению c розеткообразованием выделенных клеток.

 

Относительное количество М-РОК в исходной взвеси выделенных клеток было существенно (р_U=0,04) выше, чем в культуре клеток. Криоконсервация привела к существенному снижению процентного соотношения М-РОК по сравнению с исходными значениями как в образцах выделенных клеток (р_U=0,04), так и во взвеси культивированных клеток (р_U=0,04). Таким образом, культивирование выделенных клеток селезенки в течение 5 суток приводит к существенному снижению содержания розеткообразующих лимфоцитов и с эритроцитами барана, и с эритроцитами мыши. После 3-месячной криоконсервации происходит существенное снижение Е-РОК в некультивированном материале и менее выраженное – в культивированном, где процент Е-РОК оказывается статистически значимо выше. В отношении М-РОК криоконсервация приводит к однотипным изменениям, которые заключаются в существенном снижении фракции этих клеток.