1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации

По нашим данным, в литературе обсуждаются лишь способы выделения тканевых лимфоцитов из селезенки для иммунологических исследований, оценки антитоксических свойств препаратов in vitro [20,22,84,102].

В то же время стромальному микроокружению лимфоидных клеток в селезенке придается большое значение, поскольку оно непосредственно участвует в регуляции пролиферации, дифференцировки, выживания и синтетических функций лимфогемопоэтических клеток [5,135,136,303]. Наблюдается и обратное влияние [303].

Для получения лимфоцитов селезенки широко применяется метод механической дезагрегации [20,122], заключающийся в протирании предварительно измельченной ножницами селезенки через нейлоновую сетку [84,102] или колонку с нейлоновыми порами [192], гомогенизации и ресуспендировании ткани селезенки в питательной среде, с последующим центрифугированием [24,83,128]. Выход клеток при таком способе выделения составляет 40-50%; они представлены лимфоцитами более, чем на 90% [84]. Эритроциты удаляют с помощью гиперосмолярных растворов [22,48], а чаще - в градиенте плотности фиколла [61].

Для выделения клеток селезенки также существует метод трипсинизации ткани [114]. Трипсин является неспецифическим протеолитическим ферментом, поэтому применение этого метода сопровождается появлением продуктов тканевого распада [74].

Известен комбинированный метод дезагрегации ткани, предложенный M. Berry (1969) и модифицированный С.А. Лепеховой (1999) для выделения клеток печени свиных эмбрионов [78,159].

В два этапа применяли механическую и ферментативную (коллагеназа) обработку ткани с минимальным образованием тканевого детрита и высокой жизнеспособностью получаемого клеточного материала [78].

При выделении изолированных клеток во взвеси присутствуют т.н. «лейкоциты-пассажиры», которые обладают высокой иммуногенностью [65], образуются апоптозные тела (видоизмененые погибшие клетки) [110].

Сама процедура получения изолированных клеток селезенки ведет к повышению в них числа сестринских хроматидных обменов [128].

В процессе культивирования происходит устранение лейкоцитов-«пассажиров», что сопровождается снижением иммуногенности [65,112,160].

Культивирование и субкультивирование фибробластов приводит к элиминации поверхностных антигенов, что позволяет добиваться отсутствия реакции отторжения при их аллотрансплантации [105]. Лимфоциты селезенки мыши при культивировании также теряют способность к отторжению аллотрансплантата [179,290], но приобретают способность к пролиферации [15,77], изменяется вторичная структура их ДНК [91]. Культивирование клеток щитовидной и паращитовидной желез, а также островков Лангерганса уменьшает реакцию со стороны тканей реципиента, что связывают с потерей Iа- позитивных дендритных клеток [103].

Кроме эффекта снижения иммуногенности процесс культивирования в течение пяти суток приводит к повышению функциональной активности клеток, что описано для гепатоцитов [30, 261] и фибробластов [105].

Криоконсервация выделенного материала позволяет создавать банки клеточно-тканевых суспензий [139]. Консервацию лимфоидных клеток проводят при положительных температурах, при умеренно низких и ультранизких температурах, а также с помощью лиофилизации [69,124]. При положительных температурах лимфоциты сохраняются жизнеспособными в течение ограниченного времени, а лиофилизация приводит к значительной потери функциональной активности клеток [69], что снижает ценность этих методов консервации.

Наиболее эффективными оказались методы сохранения клеточного материала с использованием низких температур от –40⁰С до температуры жидкого азота (-193⁰С). Для криоконсервации тканевых лимфоцитов используют различные среды: Игла, Хэнкса, 199, RPMI-1640, Dulbecco, SEVAC-IV [69,124].

В качестве обязательного компонента рассматривают сыворотку крови, содержание которой колеблется от 10 до 40% объема [100]. Лимфоидные клетки замораживают под защитой различных криопротекторов: ДМСО [54,61,100,161,173,184,198,209,239,307], поливинилпирролидона [76], полиэтиленоксида (ПЭО-400) [123,334], глицерина [49,119,148].

Удельный вес жизнеспособных клеток через 3 месяца хранения с применением ДМСО (внутриклеточный консервант) невысок и составляет от 57,5- 93,1% [54,100]. При этом сохранность лимфоцитов обратно пропорциональна их концентрации с оптимумом 2,5х10⁴ в 1 мл консервирующей среды [54,100].

Другим недостатком можно считать необходимость элиминации ДМСО после размораживания в связи с его токсическим действием по отношению к лимфоцитам. Повышаются трудозатраты на предтрансплантационную подготовку, развивается дополнительное повреждающее действие на клетки при отмывании ДМСО [69]. Описаны повреждения культивированных мышиных лимфоцитов в среде с добавлением ДМСО или глицерина [96]. В качестве криоконсерванта для хранения эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов, а также клеточных взвесей различных органов, использовали гидроксиэтил крахмала, однако, после деконсервации отмечали выраженное слипание клеток [156].

Полиэтиленоксид (ПЭО), является экзоцеллюлярным криопротектором, что увеличивает жизнеспособность тканевых лимфоцитов [123]. Недостатком является необходимость удаления этого вещества перед использованием клеток т.к. ПЭО вызывает гемолиз. Другим нежелательным свойством ПЭО является его способность вызывать адгезию соматических клеток [69]. Учитывая, что при длительном хранении тканевые лимфоциты предрасположены к объединению в единый конгломерат, это значительно повышает трудоемкость работ по их подготовке для трансплантации [69].

Криоконсервация культуры эмбриональных клеток печени в среде с использованием внеклеточного протектора поливинилпирролидона, по данным С.А. Лепеховой, обеспечивала высокую жизнеспособность материала при длительном (до 6 месяцев) хранении [78].

Устройства для криоконсервации (их материал, величина, форма) постоянно совершенствуются [7,69,119,337]; для оптимизации режима охлаждения клеточного материала часто применяют пенопластовые контейнеры [74]. Деконсервацию клеток, независимо от способа замораживания, проводят на водяной бане при температуре от 37 до 41⁰С. При исходной температуре выше 40⁰С возрастает вероятность возникновения необратимых изменений в клетках, находящихся в пограничных слоях контейнера. Все криопротекторы, кроме поливинилпирролидона, необходимо удалять перед введением в организм суспензии клеток, так как они являются токсичными для организма [69].

Основным параметром для оценки сохранность клеток во взвеси на всех этапах работы является показатель жизнеспособности. Для определения жизнеспособности клеток используют метод исключения красителя с 0,2-0,4% раствором трипанового синего [62,69,85,97,102,112,274].

Функциональную активность лимфоцитов, выделенных из селезенки, после криоконсервации исследуют с помощью реакции Е-розеткообразования [69,80,100,173,306,335] и бласттрансформации с различными митогенами [79,80,144,230,323], а также оценивают их способность продуцировать цитокины [332,340]. О степени сохранности клеток можно судить также по активности биосинтеза ДНК, РНК и белка в клетках по скорости включения в клетки радиоактивных предшественников [62].

Способ введения и зона КТ клеток селезенки определяется конкретными задачами исследования. Так, внутривенная иммунизация аллогенными спленоцитами может приводить к индукции у реципиента толерантности к аллоантигенам донора [70]. Интрапортальное введение донорских спленоцитов стимулирует отдаленное выживание трансплантата печени и сердца у крыс [272]. Интратимическое введение экзогенных спленоцитов продлевает выживание ксенотрансплантата [186]. Внутрибрюшинно спленоциты вводили для изучения их влияние на потребление алкоголя животными-реципиентами [48] и для изучения влияния клеток селезенки на регенерацию печени в условиях токсического гепатита [85,97]. Для иммунологических исследований применяют подкожную КТ клеток селезенки [20,46].

Таким образом, литературные данные свидетельствуют об актуальности проблемы СПГ, особенно в раннем послеоперационном периоде. В ситуациях, когда аспленизация организма становится неизбежной, патогенетически обоснованным маневром представляется пересадка клеток селезенки – продуцентов биологически активных веществ, цитокинов. Перспективным материалом для этого представляется ксеногенная (свиная) селезенка. Разработанная технология выделения и консервация лимфоидной ткани позволяет рассчитывать на создание банка клеток. Существует информационная ниша в отношении эффективности КТ клеток селезенки для коррекции СПГ. Эти результаты литературного поиска легли в основу настоящего исследования.