2.2. Характеристика методов исследования

2.2.1. Техника оперативных вмешательств

Исследования проводили в лаборатории экспериментальной хирургии (зав. – канд. биол. наук С.А. Лепехова) НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (дир. – член-корр. РАМН, профессор Е.Г. Григорьев). Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях под внутримышечным наркозом [133].

2.2.1.1. Ложная операция

В условиях операционной под внутримышечным наркозом после обработки операционного поля 2,4% раствором первомура трижды и 70% спиртом, выполняли срединную лапаротомию. Проводили ревизию органов живота для выявления добавочных очагов селезеночной ткани, затем в рану выводили селезенку, подсчитывали количество ее сегментов. После контроля гемостаза рану послойно ушивали наглухо. При ушивании кожи накладывали узловые швы атравматической иглой с лигатурой 4/0. Кожные швы накладывали, отступая от краев раны на 2 мм с шагом 5 мм без захватывания подлежащего слоя. Данные ревизии органов живота протоколировали.

2.2.1.2. Спленэктомия

После порционного прошивания и перевязывания сосудов в воротах селезенки, выполняли спленэктомию. Тщательно избегали повреждения ткани удаляемой селезенки.

2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки

ЭП АТС выполняли по методике К.А. Апарцина (1994) [8]. После повторной обработки операционного поля 2,4% раствором первомура выполняли дополнительный трансректальный доступ слева. Тупым путем разъединяли прямую мышцу живота в нижней ее трети и обнажали поперечную фасцию. Формировали карман между мышцей и фасцией куда и помешали в один слой имплантанты селезенки в объеме 30% органа. Рану послойно ушивали.

2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки

КТ проводили через 1 час после СЭ. Животные в ОГ 1, ОГ 2 отбирались случайно. После обработки операционного поля 2,4 % раствором первомура трижды и 70% спиртом выполняли КТ ККС (ОГ-1), ИКС (ОГ-2). КТ проводили подкожно на передней брюшной стенке слева. Инъекционную иглу вводили в толщу подкожной жировой клетчатки параллельно коже на всю длину, затем при порционном введении взвеси клеток проводили постепенное потягивание иглы на себя. Таким образом, достигали равномерного распределения ксенотрансплантата в подкожной жировой клетчатке. Инъекцию 1 мл питательной среды для культивации в КГ-2 проводили аналогичным способом.

2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации

Методику выделения, культивирования и криоконсервации клеток селезенки новорожденных поросят разрабатывали в лаборатории экспериментальной хирургии научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН (зав. - канд. биол. наук С.А. Лепехова).

2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки

На этапе усовершенствования способа получения клеточной взвеси, подбора оптимальной среды для культивации и разработки способа криоконсервации клеток селезенки нами был произведен забор биоматериала у 300 новорожденных свиней однодневного возраста (порода белая русская). Новорожденных свиней сразу после рождения, до первого кормления, после ветеринарного обследования доставляли из предприятия СХПК «Усольский свинокомплекс».

Проводили внутримышечный наркоз [133], проводили тщательную очистку кожных покровов под проточной водой. Животных обескровливали путем пересечения шейных сосудов и тотчас помещали в операционную. Забор биоматериала проводили по методике G. Starke (1970) [101] в стерильных условиях.

Использованы три методики выделения клеток селезенки, в том числе, с применением механической дезагрегации по В.В. Малайцеву (1977) [84] - в 48 наблюдениях (для приготовления клеточной суспензии предварительно измельченную ткань селезенки механически протирали через нейлоновую сетку); с трипсинизацией ткани селезенки по методике Г.П. Советовой и соавт. (1976) [114] – в 48 наблюдениях (инфильтрация ткани селезенки раствором трипсина с последующим продавливанием через металлическое сито с диаметром ячеек 250 мкм) и с помощью комбинированного метода дезагрегации ткани, предложенного M. Berry (1969) [159] и разработанного С.А. Лепеховой (1999) для получения клеток эмбриональной свиной печени [78] - 204 эксперимента.

В последней серии после обработки операционного поля 2,4% раствором первомура и 70% спиртом медицинским трижды, выполняли срединную лапаротомию, в рану после предварительной мобилизации выводили селезенку, пунктировали селезеночную артерию и вводили внутриартериально 2 мл раствора коллагеназы («Sigma», США) 2,5 мг/1 г массы селезенки).

После введение раствора коллагеназы сосуды пережимали, селезенку вправляли в брюшную полость. Проводили экспозицию в течение 5 минут и иссекали орган. После взвешивания на электронных весах Adventurer^TM Balances (OHAUS, США) выделенный биоматериал доставляли для дальнейших манипуляций в стерильный бокс во флаконе с питательной средой 199 («Пан-Эко», Россия) с добавлением антибиотиков (пенициллин в дозе 1000 ед/мл и стрептомицин в дозе 1000 мкг/мл) [151,237]. Все манипуляции по получению взвеси клеток селезенки проводили в асептических условиях, используя ламинарный бокс, обработку антисептиками, кварцевание.

Использовали метод внутрисосудистого введения коллагеназы в селезенку, ранее применяемый для приготовления клеток печени [78]. Механическое измельчение ткани селезенки осуществляли под контролем зрения с дальнейшим продавливанием макрофрагментов ферментативно обработанной ткани через серию сит с постепенно уменьшающимся размером ячеек (250, 100 мкм) и затем через иглу для внутримышечной инъекции.

Селезенки помещали в чашку Петри, двукратно отмывали раствором Хэнкса и инфильтрировали раствором коллагеназы (2,5 мг/г). Затем чашки Петри с селезенками помещали в термостат на 15 минут при температуре 37⁰С. После этого ткань органов механически измельчали, удаляя сосуды и капсулу. Затем вновь помещали в термостат при температуре 37⁰С на 10 минут. Повторно измельчали фрагменты селезенки и продавливали макрофрагменты ферментативно обработанной ткани через серию медных сит с постепенно уменьшающимся размером ячеек (250, 100 мкм) и затем через иглу для внутримышечной инъекции. Раствором Хэнкса смывали прилипшие к стенкам сита фрагменты. Все отмывочные воды и полученную тканевую взвесь центрифугировали. Пробирки устанавливали в холодовую центрифугу на 2 минуты при 720 об./мин. и температуре 10⁰С [287]. Надосадочную жидкость удаляли до уровня осажденной клеточной взвеси. Повторно добавляя в пробирки раствор Хэнкса проводили центрифугирование при 1500 об./мин. в течение 30 секунд. Затем проводили этап разделения в градиенте плотности фиколла, добиваясь удаления клеточного детрита, элементов крови, крупных фрагментов. В каждую пробирку с тканевой взвесью добавляли фиколл в уменьшающейся концентрации (2,5г / 10 мл раствора Хэнкса, 2,2г / 10 мл, 1,5г / 10 мл, 1,0г / 10 мл). После центрифугирования клеточную взвесь собирали и отмывали раствором Хэнкса.

На всех этапах выделения клеток проводили контроль бактериальной контаминации [101,142]. Подсчет жизнеспособных клеток проводили с помощью теста на исключение красителя [22,61,74]. В суспензию клеток добавляли 0,4% водный раствор трипанового синего (Sigma, США) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывали число неокрашенных и окрашенных клеток. Затем половину выделенных клеток культивировали, а в оставшуюся клеточную взвесь добавляли среду консервации, приготовленную по оригинальной прописи (заявка на изобретение «Среда для консервации клеток селезенки»; приоритетная справка № 2001101802 \ 20 (001594) от 18.01.2001) до концентрации 2,15 х10⁷ клеток в 1 мл суспензии. Полученную cуспензию клеток разливали по полиэтиленовым ампулам объемом 4,5 мл. Криоконсервацию осуществляли при температуре –70⁰С. Замораживание производили в футлярах из пенопласта с толщиной стенок 1 см, со скоростью снижения температуры 1⁰С/ мин.[74]

Культивирование выделенных клеток проводили в матрацах Ру с использованием стандартных питательных сред и добавок, производимых фирмой «Пан-Эко» (Россия) по методу Р. Фрешни (1989) [74].

Для определения оптимального рН среды для культивации проведена серия стендовых экспериментов, в которых 0,2 мл клеточной взвеси, полученной комбинированным методом дезагрегации, добавляли в 1 мл среды RPMI с исходным рН от 6,8 до 8,2 (закисление среды проводили с помощью цитрата, ощелачивание – добавлением 0,1N NaOH). Инкубировали культуру в течение 2 часов при температуре 37⁰С, после чего повторно измеряли рН среды и подсчитывали жизнеспособность клеток.

Культивирование проводили в стандартных условиях в течение 5 суток и трехкратной сменой питательной среды с элементами субкультивирования, которое заключалось в диспергировании клеточной взвеси на этапе смены питательной среды [74]. Применяли среду для культивирования в оригинальной модификации (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» №194 от 07.03.2001, зарегистрированное НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН).

Для снятия культуры клеток со стенок посуды применяли версен 0,2 г/л раствора Хенкса по методике Р. Адамса (1983) [3]. Полученные клетки центрифугировали в течение 30 с при 1500 об.\мин., после удаления надосадочной жидкости клеточную взвесь криоконсервировали описанным выше способом. В 18 наблюдениях для криоконсервации использована среда Ю.М. Зарецкой и соавт. (1978), содержащая в качестве криопротектора внутриклеточный консервант диметилсульфоксид [54].

Консервированные клетки хранили при температуре –70⁰ С в течение 3-6 мес. Замораживание проводили при скорости снижения температуры –1⁰ С в минуту, что достигалось применением контейнеров из пенопласта с толщиной стенки 1 см [74].

Для ксенотрансплантации использовали клетки, консервированные в течение 3 мес., а материал, сохраненный в течение 6 мес., исследовали для сравнительной оценки жизнеспособности. Ампулы с клетками отогревали на водяной бане при температуре 41^оС [74]. После вскрытия ампул в асептических условиях оценивали жизнеспособность клеток вышеуказанным способом. Функциональную способность фракции лимфоцитов в клеточной взвеси оценивали реакцией розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) и мыши (М-РОК) [54,92,98].

Для ксенотрансплантации использовали взвесь полученного материала с содержанием не менее 90% жизнеспособных клеток.