2.3.Методы статистической обработки

Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). При нормальном распределении в выборке данные представлены в средних величинах со средней квадратической ошибкой [21].

Величины, выраженные в процентах, приведены в тексте с ошибкой процента. Определение значимости различий полученных данных (р) в сравниваемых выборках проведено по критериям Манна-Уитни (U), Вилкоксона (W) и с помощью точного метода Фишера (F) [41] .

Корреляционный анализ данных в выборках с ненормальным распределением проводили с применением непараметрического коэффициента корреляции Спирмена (r_s) [140].

Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакета программ Statistica 5.1. for Windows [27].

 

 

 

Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации

В процессе работы мы не встретили методик, предназначенных для выделения всех типов клеток селезенки. Большинство авторов выделяли из селезенки только лимфоциты. В этой связи предстояло определить оптимальные режимы выделения, культивирования и криоконсервации клеточного материала. Обратимся к результатам этого раздела работы.

3.1.Технология выделения клеток селезенки

Поскольку методика забора материала была стандартной, обратимся к результатам получения клеточной взвеси в наших экспериментах.

3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки

Результаты выделения клеток селезенки с помощью использованных нами способов представлены в табл. 3.1. Полученная при механической дезагрегации взвесь по данным цитологического исследования (мазки-отпечатки) содержала конгломераты клеток (100 клеток и более), изолированные лимфоциты, и клеточный детрит. Оказалось, что полученную взвесь очень трудно стандартизировать по составу и фракционировать в силу больших размеров клеточных конгломератов. Процент жизнеспособности изолированных клеток был низким и составил 68% (68-70) при минимальном количестве клеток, полученном из 1 г ткани селезенки – 0,2 (0,19-0,23) х 10⁷. Так как потеря клеток при механической дезагрегации была обусловлена отсутствием диссоциации крупных конгломератов, мы применили известный способ выделения клеток путем трипсинизации ткани селезенки. Выход изолированных клеток был невелик и составил 1,20 (1,18-1,22) х10⁷ на 1 грамм ткани при содержании жизнеспособных клеток 74,0% (74,0-76,0).

Таблица 3.1

Сравнительная эффективность способов выделения клеток селезенки новорожденной свиньи (медиана, нижний и верхний квартили)

Способ выделения клеток	n	Удельный вес жизнеспособных клеток (%)	Кол-во клеток, полученных из 1 г ткани селезенки, x 107
Механическая дезагрегация ткани селезенки	48	68,0 (68,0-70,0)*	0,20 (0,19-0,23)*
Трипсинизация ткани селезенки	48	74,0 (74,0-76,0)*	1,20 (1,18-1,22)*
Комбинированный способ дезагрегации (разработанный)	204	99,4 (98,9-100,0)	6,15 (5,86-6,40)

Примечание: * - значимые различия показателя (p_U<0,05) по сравнению с комбинированным методом дезагрегации.

 

В дальнейшем в связи с перечисленными недостатками мы отказались от применения названных методов. В основу нашей методики мы положили приемы выделения материала, разработанные для получения эмбриональных клеток печени (Berry M., 1969; Лепехова С.А., 1999) посредством комбинированной диссоциации с применением коллагеназы на начальном этапе. Добивались выделения изолированных клеток селезенки и жизнеспособных микрофрагментов (не более 10 клеток в ассоциации) селезенки новорожденной свиньи, поскольку культивация более крупных фрагментов сопровождается некрозом центральной зоны. Такая степень диссоциации облегчает стандартизацию полученной взвеси клеток по составу и подсчет клеток в камере Фукса-Розенталя, которую мы использовали в работе. Центрифугированием клеток в прерывистом фиколловом градиенте добивались очистки клеточной суспензии и удаления клеточного детрита, элементов периферической крови, крупных фрагментов, поврежденных клеток. Выбранный способ дезагрегации позволил получить взвесь изолированных клеток и микрофрагментов по 2-4 клетки.

Как видно из табл. 3.1, применение разработанной методики позволило существенно (р=0,04) повысить жизнеспособность клеток (98,9-100 %) и количество материала, получаемое из 1 г ткани селезенки (5,86-6,40 х 10⁷). Вес одной селезенки новорожденного поросенка по нашим данным составил 1,05 г (0,9-1,1).

При цитологическом исследовании биоматериала, полученного по модифицированной нами методике, сразу после выделения состав клеточной суспензии был представлен изолированными лимфоцитами, макрофагами, моноцитами и ретикулярными клетками. Иногда клетки располагались группами по 2-4, встречались апоптозные тела и единичные нейтрофильные лейкоциты. Ядра клеток расположены преимущественно в центре гомогенной цитоплазмы. Ядра малых, средних и больших лимфоцитов содержат отростки, встречаются клетки с мелкозернистым хроматином, цитоплазма с четкой границей. Ретикулярные клетки с овальными ядрами, широкой зернистой цитоплазмой, с редкими вакуолями (рис. 3.1).

Рис. 3.1 Клетки селезенки новорожденных поросят после выделения из органа. Окраска по Романовскому. Об. 100^х , Ок. 10^х.

 

На следующем этапе нашей работы мы проводили подбор рациональных условий для культивации полученной взвеси клеток селезенки.