- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Общая характеристика экспериментального материала
Исследование выполнено на основании серии экспериментов in vitro, в которой использовано 300 селезенок новорожденных свиней, и 2 серий хронических экспериментов на 248 белых крысах-самцах линии Вистар 6-месячного возраста с массой тела 200-250 г . Эксперимент проведен в зимне-весенний период.
У всех экспериментальных крыс, за исключением животных контрольной группы №3 (КГ-3, ложная операция), в стерильных условиях проводили индукцию гипоспленизма путем спленэктомии и удаления всех обнаруженных очагов резидуальной ткани (полная аспленизация). В контрольной группе №1 спленэктомию дополняли экстраперитонеальной аутотрансплантацией ткани селезенки (АТС). Через 1 час после оперативного вмешательства остальных животных относили к экспериментальным группам методом случайного распределения, таким образом, в исследование вводили животных с индуцированным постспленэктомическим гипоспленизмом. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность.
В первой серии эксперимента (150 животных) проведено исследование летальности у спленэктомированных животных под влиянием ксенотрансплантации криоконсервированных культивированных (ККС) (ОГ-1) и изолированных (ИКС) (ОГ-2) клеток селезенки, аутотрансплантации ткани селезенки (ЭП АТС) (КГ-1), и инъекции питательной среды (КГ-2). Табл. 2.1 Летальность контролировали на протяжении 21 суток.
Таблица 2.1
Распределение животных на группы в первой серии экспериментов (исследование летальности)
Номер группы |
Характер воздействия |
Количество животных |
1 (ОГ 1) |
СЭ + подкожная инъекция 2х106 криоконсервированных ККС в 1 мл взвеси |
30 |
2 (ОГ 2) |
СЭ + подкожная инъекция 2х106 криоконсервированных ИКС в 1 мл взвеси |
30 |
3 (КГ 1) |
СЭ + экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки |
30 |
4 (КГ 2) |
СЭ + подкожная инъекция 1 мл питательной среды для культивации |
30 |
5 (КГ-3) |
Ложная операция (лапаротомия, ревизия селезенки с подсчетом сосудистых сегментов) |
30 |
Всего: |
150 |
|
У всех погибших животных производили аутопсию с ревизией органов брюшной полости. Для гистологического исследования забирали ткань легкого и печени. Для бактериологического исследования брали ткань легкого и экссудат из плевральной полости. У выживших животных на 21 сутки исследовали показатели гомеостаза, затем подвергали эвтаназии. Выполняли аутопсию, забирали печень, легкие и ткань в месте трансплантации для морфологического исследования.
Во второй серии опытов (98 животных) проведены ранотензиометрия, исследование показателей гомеостаза (биохимические тесты и оценка системы гемостаза), иммунологических показателей, общего анализа крови и морфологии печени и легких под воздействием ксенотрансплантации (КТ) криоконсервированных (ККС) (ОГ-1), КТ криоконсервированных (ИКС) (ОГ-2), экстраперитонеальной аутотрансплантации (ЭП АТС) (КГ-1), инъекции питательной среды для культивации (КГ-2) и ложной операции (ЛО) (КГ-3)- табл.2.2.
Таблица 2.2
Распределение животных на группы во второй серии эксперимента
Номер группы |
Характер воздействия |
Количество животных |
1 (ОГ 1) |
СЭ + подкожная инъекция 2х106 криоконсервированных ККС в 1 мл взвеси |
20 |
2 (ОГ 2) |
СЭ + подкожная инъекция 2х106 криоконсервированных ИКС в 1 мл взвеси |
25 |
3 (КГ 1) |
СЭ + ЭП АТС |
20 |
4 (КГ 2) |
СЭ + подкожная инъекция 1 мл питательной среды для культивации |
15 |
5 (КГ 3) |
Ложная операция (лапаротомия, ревизия селезенки с подсчетом сосудистых сегментов) |
18 |
Всего: |
98 |
|
Выживших животных выводили из эксперимента на 7 сутки (по 6 крыс в каждой группе), 14 сутки (в группах 1,2,4,5) и 21 сутки (в 5 группе). Осуществляли забор крови для оценки выбранных биохимических, иммунологических и системы гемостаза показателей. Забор крови для лабораторного исследования проводили у всех крыс в утренние часы на голодный желудок. Выполняли ранотензиометрию (на 7 сутки) во всех экспериментальных группах. После эвтаназии проводили аутопсию и забирали ткань печени и легкого, а у крыс 1, 2 и 3 групп дополнительно иссекали ткань в зоне трансплантации для последующего патоморфологического исследования.