Структура и функция гена: молекулярная парадигма

Вскоре выяснилось, что и как кодируют гены. Первые соображения о природе генетического кода высказал в 1954-1956 гг. американский физик русского происхождения Г. Гамов. Самым разумным предположением, высказанным в доэкспериментальный период обсуждения кода, было соображение о том, что код, скорее всего триплетен, т.е. одной аминокислоте в белке соответствует сочетание из трех пар нуклеотидов в ДНК. В 1961 г. Крик и его коллеги опубликовали блестящее экспериментальное исследова­ние природы генетического кода. Это был в чистом виде генетический ана­лиз, основанный на получении мутаций-вставок и выпадений пар нуклеоти­дов, а также их совмещения в одном гене путем рекомбинации с использова­нием разработанной Бензером системы rII фага Т4. Стало ясно, что код дей­ствительно триплетный, считывается с фиксированной точки в пределах гена, триплеты не отделены запятыми друг от друга. Скорее всего, код вы­рожденный, или избыточный и, как показали дальнейшие работы, код уни­версальный или точнее квазиуниверсальный. Это достижение было знаменательным еще и в связи с тем, что оно показало огромные возможности генетического анализа, даже в изучении сугубо молекулярных характеристик живых систем (определении свойств генетического кода). В то же время эта работа показала пределы возможностей генетического анализа, так как, определив свойства кода, расшифровать его только генетическими методами нельзя. Требовался переход на другой уровень организации материи. Очередь была за биохимиками.

Уже в 1950-е гг. биохимики и цитологи пришли к представлению о том, что синтез белка в эукариотической клетке происходит в цитоплазме и зави­сит от РНК. А. Н. Белозерский и А. С. Спирин в 1956 г. предположили, а Е. Волкин и Е. Астрачан в 1957 г. доказали существование специального клас­са РНК - информационной, или мессенджер-РНК (иРНК, или мРНК), перено­сящей информацию от ДНК к месту белкового синтеза на рибосомах. Это было сделано с использованием системы «фаг Т2-бактерия Е. coli, в которой после инфекции появлялась РНК, соответствующая по нуклеотидному соста­ву ДНК бактериофага. Таким образом, информация, кодирующая структуру белков, переносится с ДНК на мРНК и затем считывается на рибосомах в ходе синтеза белков.

Роль второго важнейшего участника в реализации генетической информа­ции, транспортных РНК (тРНК), была определена еще до их открытия. В 1955 г. Ф. Крик в статье, которая тогда не была опубликована, постулировал существо­вание полинуклеотида-адаптера, который несет аминокислоты и образует водо­родные связи с кодирующей полинуклеотидной матрицей. Адаптерная гипотеза была доказана в работе Ф. Шапвиля и других в 1962 г. Расшифровка кодонов in vitro в бесклеточных сис­темах синтеза белка началась с работы М. Ниренберга и Дж. Матей, доложенной в 1961 г. на Московском биохимическом конгрессе. Добавив в бесклеточную систему белкового синтеза полиуридиловую РНК, авторы получили на выходе полипептид – полифенилаланин. Дальнейшая расшифровка всех 64-х возможных триплетов, составлен­ных путем комбинирования четырех нуклеотидов в мРНК, была завершена в 1964-1965 гг. За эти исследования М. Ниренберг и Г. Корана в 1968 г. были удостоены Нобелевской премии. Третьим стал Р. Холи, расшифровавший первичную структуру первой тРНК (аланиновой тРНК дрожжей). Так сложилась молекулярная парадигма в представлениях о структуре и функции генов.

В 1961 г. на Московском международном биохимическом конгрессе произошло и другое важное событие - Ф. Жакоб и Ж. Моно представили схему регуляции действия генов у бактерий на уровне транс­крипции-синтеза мРНК (Нобелевская премия за 1965 г.). Это была схема оперонной регуляции, ставшая затем классической и положенная в основу изуче­ния регуляции действия гена у всех организмов.

Окончательная конкретизация представлений о строении генетического материала связана с разработкой методов установления первичной структу­ры нуклеиновых кислот. Решающую роль в этом процессе сыграло открытие ферментов-эндонуклеаз рестрикции, или рестриктаз. Все началось с открытия С. Лурия, Г. Бертани и Дж. Уэйглом в первой половине 1950-х гг. явления рестрикции-модификации бактериофагов. В 1962 г. В. Арбер (Нобе­левская премия 1978 г. совместно с Д. Натансом и X. Смитом) показал, что в клетках бактерий Е. соli существуют ферменты, модифицирующие (в основ­ном метилирующие) основания ДНК и, тем самым, предохраняющие ее от разрушения собственными рестриктазами. Не модифицированная ДНК рас­щепляется рестриктазами, узнающими специфические последовательности, состоящие примерно из 5 пар нуклеотидов. В начале 1970-х гг. Смит подтвер­дил открытие Арбера для бактерии Наеторhylus inf1иепсае, а Натанс использо­вал рестриктазы для анализа структуры ДНК обезьяньего вируса SV40. Так было положено начало физическому (рестрикционному) картированию мо­лекул ДНК, в котором маркерами служили сайты рестрикции для различ­ных эндонуклеаз рестрикции, благо разнообразие рестриктаз разной специ­фичности оказалось огромным.

Использование рестриктаз легло в основу метода определения первичной структуры (секвенирования) ДНК, разработанного в середине 1970-х гг. А. Максамом и У. Гилбертом, которые использовали разработки А. Д. Мирзабекова и Е. Д. Свердлова, сделанные в Институте молекулярной биологии АН СССР. В 1973 г. Ф. Сенгер предложил иной метод секвенирования ДНК, основанный на остановке репликации ДНК на каждом из четырех нуклеотидов. В 1980 г. Ф. Сенгер и У. Гилберт вместе с П. Бергом были удостоены Нобелевской премии по химии. Это была вторая Нобелевская премия по химии Сенгера. Первую он получил в 1958 г. за метод секвенирования белков.

В 1983 г. К. Маллис (Нобелевская премия по химии за 1993 г.) открыл по-лимеразную цепную реакцию—широко применяемый ныне метод ПЦР, по­зволяющий амплифицировать (избирательно синтезировать) любой участок генома, если известна хотя бы часть его нуклеотидной последовательности. Методы ферментативного анализа нуклеиновых кислот в 1970 г. дополнило открытие Г. Теминым и Д. Балтимором (Нобелевская премия в 1975 г.) РНК-зависимой ДНК-полимеразы, известной как обратная транскриптаза, или ревертаза. Этот фермент способен делать копии ДНК на геноме некото­рых вирусов, чей генетический материал представляет РНК. К их числу отно­сится вирус иммунодефицита человека (СПИД). Использование этого фер­мента позволяет синтезировать ДНК-копии любых мРНК in vitro.

На этих методах выросли так называемые геномные проекты, направлен­ные на установление полной нуклеотидной последовательности ДНК разных ви­дов, из которых наиболее известен «Геном человека», практически завершенный к началу XXI столетия. На базе этих исследований на рубеже веков родилась новая наука— геномика.

Еще раньше в результате разработки проблемы гена родилась еще одна наука, производная от генетики – генная инженерия, основанная в огромной степени на технике рекомбинантной ДНК. П. Берг был одним из первых исследователей, разрабатывавших в 1960-х гг. технику рекомбинантной ДНК и осознавших значение этого мето­да, широко используемого ныне в генной инженерии, для получения и клони­рования генов. Рождение генной, или генетической, инженерии произошло в начале 1970-х гг. В 1974 г. по инициативе П. Берга в Асиломаре (США) про­шла конференция, на которой впервые были высказаны опасения о возмож­ных негативных для человечества последствиях экспериментов по клонированию генов болезнетворных бактерий, вирусов и генов человека. Хотя эти опасения оказались сильно преувеличенными, они были первым предупреждением о грядущих морально-этических проблемах, с которыми ученые столкнулись после того, как в 1997 г. И. Уилмут доказал возможность клонирования млекопитающих.