Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Составьте таблицу «Реакции иммунитета» по схеме:

Реакция иммунитета	Антиген	Антитела	Проявление реакции	Способы постановки	Применение

Таблица будет продолжена на следующем занятии.

Работа студента на практическом занятии.

1. Демонстрация развёрнутой реакции агглютинации.

Цель опыта: определить титр агглютинирующей сыворотки.

Материал: агглютинирующая сыворотка, взвесь бактерий, физиологический раствор.

Ход опыта: начертить таблицу: Номера пробирок, разведение сыворотки.

Порядок постановки. Взять 6 пробирок. Во все пробирки налить по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1 пробирку налить 1 мл агглютинирующей сыворотки, разведенной 1:50. Перенести 1 мл из 1-ой во 2-ю, из 2-ой в 3-ю, из 3-й в 4-ю, из 4-й в 5-ю, а из 5-ой пробирки вылить 1 мл в дезинфицирующий раствор. Добавить по 2 капли антигена во все пробирки. Поставить на 2 часа в термостат, после чего учесть результат.

Номера пробирок	1	2	3	4	5	6
Физ. раствор, мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Агглютинирующая сыворотка в разведении 1:50, мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1мл вылить
Антиген (взвесь бактерий в каплях)	2	2	2	2	2	2
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	контроль антигена
Результат

Результат: отметьте, в каких пробирках произошла агглютинация.

Вывод: укажите титр сыворотки.

2. Постановка реакции агглютинации на стекле.

Цель опыта: определить, являются ли антигены бактерий и антитела иммунной сыворотки специфичными друг для друга.

Материал: физиологический раствор, иммунная сыворотка, культура бактерий на скошенном агаре.

Ход опыта: нарисуйте.

Результат: отметьте на рисунке.

Вывод: сформулируйте.

3. Изучите реакцию пассивной гемагглютинации по таблице и по демонстрационной реакции.

4. Постановка реакции преципитации.

Цель опыта: определить видовую принадлежность белка крови.

Материалы: вытяжка из кровяного пятна, преципитирующие сыворотки против белка человека и белка барана.

Ход опыта: таблица.

Результат: отметьте, в какой пробирке произошла преципитация.

Вывод: сформулируйте.

5. По демонстрационной реакции преципитации в агаровом геле определите токсигенность дифтерийных палочек. Укажите, какие культуры являются токсигенными.

6. Изучите диагностические препараты. Препараты, содержащие антиген: диагностикумы, эритроцитарные диагностикумы. Препараты, содержащие антитела: агглютинирующие сыворотки, преципитирующие сыворотки.

Занятие 11

Реакции иммунитета (окончание).

Цель самоподготовки.

После самостоятельного изучения материала необходимо знать о каждой из реакций:

- ингредиенты;

- механизм реакции;

- методы и схемы постановки;

- практическое применение;

- диагностические препараты.

Исходный уровень знаний.

Для усвоения материала необходимо повторить материал предыдущих занятий: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета.

Цель занятия.

1. Изучить механизм и методы постановки реакций:

- иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза;

- реакции связывания комплемента (РСК);

- реакции иммунофлюоресценции (РИФ);

- реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга;

- реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

2. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.

План изучения темы.

1. Реакции иммунного бактериолиза и гемолиза

2. Реакция связывания комплемента

3. Реакции с использованием меченых антигенов и антител: реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ, иммуноэлектронная микроскопия.

После изучения темы студент должен уметь.

Учесть и интерпретировать результаты следующих реакций:

- РСК;

- РИФ;

- ИФА;

- иммуноблоттинга;

- иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

Дополнительный материал к занятию.

Реакции иммунитета с использованием меченых антигенов и антител основаны на том, что один из ингредиентов, участвующих в реакции (антигены или антитела), соединяют с какой-либо меткой, которую легко можно обнаружить. В качестве метки используют флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электроноплотные соединения (ИЭМ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), как и другие реакции иммунитета, используется: 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом (например, пероксидазой). Присутствие фермента определяют с помощью субстрата, который при действии фермента расщепляется и среда окрашивается. Наиболее широко применяется твёрдофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена. Первый этап - адсорбция специфических антител на твёрдой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, если в исследуемом материале имеются антигены, на поверхности твёрдой фазы образуется комплекс антитела - антиген - антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н₂О₂ в буферном растворе. Под действием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-системах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. Третий этап - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеческих глобулинов), меченые ферментом. Результаты реакции оценивают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные, которые имеются в коммерческих системах.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это разновидность ИФА (сочетание электрофореза и ИФА). Методом электрофореза в геле разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделённые молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченую пероксидазой, затем субстрат, который под действием фермента расщепляется и среда приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод позволяет определить количество антигена в исследуемой пробе. Сначала к иммунной сыворотке присоединяют материал, предположительно содержащий антиген, затем - известный антиген, меченый радиоизотопом, напримерI¹²⁵. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного меченого антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счетчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяется специфическая антисыворотка, меченая электроноплотным веществом. В качестве метки применяют металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.