3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

ГЛАВА 12. ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ.

ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

12.1. ОРГАНОПРЕПАРАТЫ. ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ

ПОЛУЧЕНИЯ

В современных условиях большую часть органопрепаратов получают пу­ тем химического синтеза и методами генной инженерии. Но органы и ткани животного происхождения до настоящего времени являются важным источни­ ком сырья для производства простагландинов, гормонов, ферментов и других препаратов животного происхождения.

Сырье для производства органопрепаратов (ткани и железы) получают на бойнях от здоровых, нормально развитых животных. Свежие органы содержат значительное количество воды, балластных белков, липидов, минеральных ве­ ществ, продуктов клеточного обмена. Животное сырье чрезвычайно лабильно и быстро портится в связи с высокой неустойчивостью к действию микроорга­ низмов, ферментов, стимулирующих гидролитические процессы. Поэтому по­ лученное после забоя животных сырье быстро перерабатывают или немедленно консервируют, в основном замораживанием при температуре 30-40 градусов ниже нуля в скороморозильных шкафах. В таком виде легко портящееся сырье можно транспортировать в специальных рефрижераторах и хранить при темпе­ ратуре 15-18 градусов ниже нуля и относительной влажности 90-95%.

Иногда для консервирования сырья применяют органические растворите­ ли, смешивающиеся с водой и в то же время не оказывающие разрушающего влияния на биологически активные вещества, чаще всего ацетон и этанол. Спо­ соб прост и эффективен, но требует 3-5 - кратного количества растворителя для обезвоживания; при этом происходит и частичное обезжиривание. Этанол - хо­ роший консервант для яичников и семенников, ацетон - для ткани гипофиза. Перспективным методом консервирования биоматериала, обеспечивающим со­ хранение биологически активных веществ, является сублимационная сушка - извлечение влаги из замороженного сырья в условиях глубокого вакуума.

Общую технологическую схему производства органопрепаратов можно проследить на рис. 12.1.

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

Сырье, поступающее на переработку обычно в замороженном виде, раз­ мораживают, очищают от механических примесей (загрязнений, остатков кро­ ви) ополаскиванием в воде, освобождают от остатков посторонних тканей (жир, мясо) преимущественно вручную при помощи ножа или ножниц и измельчают на механизированных мясорубках - волчках, превращая в фарш. Дальнейшая специальная обработка сырья проводится в зависимости от степени очистки и типа получаемого препарата.

По технологическому признаку органопрепараты подразделяют на:

-препараты, представляющие собой высушенные, обезжиренные и из­ мельченные железы;

-экстракционные органопрепараты;

-органопрепараты для парентерального введения.

Технология препаратов, представляющих собой высушенные, обез­

жиренные и измельченные железы. При получении препаратов этой группы (тиреоидин, аудиуретин и др.) сырье немедленно сушат в вакуум-сушилке при температуре не превышающей 50 оС тонким слоем, намазывая фарш на стек­ лянные или эмалированные противни. После бережного высушивания материал обезжиривают, экстрагируя в аппаратах типа «Сокслета» органическими рас­ творителями с низкой температурой кипения, хорошо извлекающими жиры и не разрушающими биологически активные вещества. Остатки растворителя уда­ ляют из сырья просушиванием в вакуум-сушилке или на воздухе в вытяжном шкафу. Сухой обезжиренный материал превращают в порошок в фарфоровых шаровых мельницах. Выпускают препараты в виде дозированного порошка или таблеток.

Для получения экстракционных органопрепаратов и получения вы­ тяжки-сырца для производства максимально-очищенных органопрепаратов ис­ пользуется экстрагирование. Экстракцию проводят индивидуально подобран­ ным экстрагентом, методом одно-, двухили многократной мацерации в аппа­ ратах, снабженных мешалками.

В качестве растворителей используют: водные растворы кислот, ацетон, этанол со строго определенными значениями pH, обеспечивающим максималь­ но возможный выход БАВ. Продолжительность экстракции - от нескольких ча­ сов до нескольких суток. Экстракт отделяют процеживанием через плотные

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

1.Препараты в виде экстрактов из эндокринных желез или из высушенной ткани эндокринных желез (тиреоидин);

2.Препараты природных гормонов, которые получены из крови и мочи жи­ вотных и людей (гонадотропин);

3.Препараты синтетических гормонов, которые по своей химической струк­ туре не отличаются от природных (преднизолон);

4.Синтетические препараты с гормоноподобными свойствами (производные стильбена);

5.Комбинированные препараты (эстроген-гестагенные);

6.Препараты, полученные путем генной инженерии (препараты инсулина). По химической структуре их подразделяют на несколько групп:

•Гормоны белковой природы: простые (инсулин, пролактин, гормон роста) и сложные (фолатропин, лютропин, тиротропин) белки.

•Гормоны пептидной природы: глюкоген, кальцитонин, соматостатин, вазопресин, окситоцин.

•Гормоны - производные аминокислот: адреналин, норадреналин, окситоцин.

•Гормоны липоидной природы (стероидные гормоны): кортикостерои­ ды, андрогены-эстрогены, простагландины.

•Парагормоны, тканевые гормоны: гастрин, секретин, гепарин. Классификация гормонов по месту образования представлена в табл. 12.1.

Таблица 12.1.

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

Инсулин (Insulinum, от лат. Insula - остров) - гормон поджелудочной же­ лезы, который вырабатывается бета-клетками островков Лангерганса. Инсулин является белком с молекулярной массой около 6000, имеющим 51 аминокисло­ ту и две цепи: А, состоящую из 21 и В - из 30 аминокислот, соединенных ди­ сульфидными мостиками. Основным сырьем для получения инсулина является поджелудочная железа рогатого скота и свиней.

Впервые в 1921 году, в Торонто канадские исследователи Ф.Г. Бентинг и Ч.Х. Бест выделили инсулин из поджелудочной железы собаки при обработке ее подкисленным этанолом. Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 году, благодаря применению новейших методов очистки гормона (иммуноэлек­ трофорезу и жидкостной хроматографии высокого разряжения) от других гор­ мональных веществ. В настоящее время существует несколько технологий вы­ деления инсулина из поджелудочных желез рогатого скота и свиней. Ниже при­ веден наиболее перспективный способ, применяемый на фармацевтических предприятиях.

Получение инсулина складывается из следующих стадий:

1.Измельчение замороженных поджелудочных желез и экстракция кис­ лым спиртовым раствором.

2.Осаждение балластных белков (рН 7,5) и освобождение от липидов.

3.Изоэлектрическое осаждение фракции инсулина (при рН 5,5) и осажде­ ние спиртом, ацетоном, эфиром.

4.Очистка инсулина: осаждение солями, фракционирование методами хроматографии, гель-фильтрации и др.

5.Кристаллизация инсулина.

6.Переосаждение цинк-инсулина.

Свежие или замороженные поджелудочные железы измельчают на мясо­ рубке-волчке и экстрагируют ремацерацией первый раз 80-85% этанолом в ре­ акторе с мешалкой. Второй раз экстрагируют 57% этанолом, который подкис­ лен ортофосфорной кислотой (хлористоводородной или серной) до значения рН 2,8-3. Экстракцию проводят 1,5 - 4 часа при постоянном перемешивании. Под­ кисленный спирт способствует инактивации фермента трипсина, находящегося в поджелудочной железе, благодаря чему удается сохранить инсулин в неиз­ менном состоянии. На некоторых предприятиях используют роторно-

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

пульсационный аппарат для экстракции, что в значительной мере определяет интенсивность экстрагирования инсулина (1,5 часа).

Полученные вытяжки объединяют, оставляют на холоду на 48 часов для освобождения от нежелательных белков, которые выпадают в виде осадка. Оса­ док отделяют центрифугированием и удаляют. Затем для выделения и очистки инсулина применяют ионообменную хроматографию (наиболее прогрессивный способ очистки). Осуществляют сорбцию инсулина из прозрачной жидкости на макропористом сульфокатионите КУ-33-30/100 при значении рН 3,0-3,3 в ре­ жиме псевдоожижения. Липиды удаляют путем промывки катионита 65-67% этанолом, при этом балластные белки удаляют промыванием 0,3 М раствором ацетатного буфера (рН 5,3).

Десорбцию инсулина осуществляют быстро с помощью 0,01 - 0,05 М рас­ твора аммонийного буфера (при рН 10) и немедленно подкисляют кислотой хлористоводородной до значения рН 4,5, добавляют ацетон. Выпавший осадок балластных веществ удаляют. Инсулин осаждают раствором цинка ацетата (при рН 6,2) - получают цинк-инсулин, который очищают кристаллизацией. Цинкинсулин растворяют в воде, подкисленной кислотой лимонной до значения рН 2,8. Раствор отстаивают в течение 1 часа, выпавший осадок балластных белков удаляют фильтрованием через кизельгур. Фильтрат смешивают с ацетоном, до­ бавляют цинк хлористый и фенол, охлаждают до температуры 0°С. Для мед­ ленной кристаллизации инсулина создают условия с последовательным посте­ пенным изменением рН раствора. Раствор подщелачивают до значения рН 8,5; оставляют на 2-3 мин, затем создают значение рН 6,8, перемешивают 1 час; при значении рН 6,5 перемешивают 2 часа; при значении рН 6,2 и 6,0 перемешива­ ют 2 часа и отстаивают 20 часов; при значении рН 5,8 перемешивают 2 часа и отстаивают 48-96 часов при температуре 5°С. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают последовательно ледяной очищен­ ной водой, ацетоном, эфиром. Досушивание проводят на воздухе или сушиль­ ном шкафу.

Многие фармацевтические предприятия и компании проводят широко­ масштабные исследования по усовершенствованию технологии получения ин­ сулина. Так, Датская компания «Ново индастри» производит человеческий ин­ сулин методом генной инженерии, в основе которого лежит замена остатка ала­

ПРЕПАРАТЫ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ. ПРЕПАРАТЫ ГОРМОНОВ

нина, в цепи В на остаток треонина. Этого удалось достигнуть путем фермента­ тивного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта; в результате чего был получен однокомпонентный инсулин человека 99%-ной чистоты.

Исследования американской компании «Эли Лилли» привели к более вы­ сокому техническому уровню производства и процессов очистки инсулина. На­ чиная с 1980 года, все выпускаемые инсулины изготовляются с применением ионообменной хроматографии на стадии дополнительной очистки.

Компания «Эли Лилли» - один из крупнейших центров по разработке технологии создания инсулина методами генной инженерии. В частности в не­ патогенных Е-12 штаммах клеток E. Coli осуществлен биосинтез инсулина. Для этого на РНК проинсулина с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. Молекула проинсулина сворачивается и после образования ди­ сульфидных связей образует молекулу инсулина. Процедура строгой очистки, связанная с производством человеческого инсулина на основе рекомбинантной ДНК, включает в себя изоэлектрическое осаждение и кристаллизацию, гель­ фильтрационную хроматографию, ионообменную хроматографию.

В настоящее время выпускается несколько разновидностей препаратов инсулина.

Инсулин для инъекций (Insulinum pro injectionibus) получают путем рас­ творения кристаллического инсулина в воде, подкисленной кислотой хлорово­ дородной до значения рН 3,0-3,5. К раствору добавляют солюбилизатор (1,6­ 1,8% глицерина) и в качестве консерванта - фенол (0,25-0,3%). Раствор стери­ лизуют фильтрованием через стерилизующие фильтры. В 1 мл содержится 40 или 80 ЕД.

Суинсулин (Suisulinum) - раствор кристаллического инсулина, получае­ мого из поджелудочной железы свиней, в ацетатном буфере. Раствор имеет зна­ чение рН 7,0-7,5; в качестве консерванта используется нипагин. В 1 мл содер­ жится 40 или 80 ЕД. Форма выпуска по 5 или 10 мл во флаконах, укупоренных резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками.

Применяют оба препарата главным образом для лечения сахарного диабета. Они оказывают относительно непродолжительное сахароснижающее действие.