3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

став которых точно известен. Такие среды называют синтетическими. Однако, в большинстве случаев применяют синтетические среды не как таковые, а в смеси с сывороткой или другими биологическими продуктами, химический со­ став которых неизвестен. Основу любых питательных сред составляют раство­ ры неорганических солей. Питательные среды различаются между собой не только по содержанию пищевых субстратов, но и по содержанию неорганиче­ ских солей. В одних случаях они обеспечивают клональный рост одиночных клеток, в других - массовое размножение клеток, в третьих - поддержание жизнеспособности выросших (неделящихся) клеток. В соответствии с такой классификацией питательных сред степень их питательной ценности сущест­ венно меняется. Среды для кратковременного поддержания жизнеспособности клеток (поддерживающие среды) имеют более простой состав, чем для дли­ тельного размножения (ростовые среды). Их состав может также зависеть от характера культивируемых клеток и способа выращивания. Качество питатель­ ных сред определяется в первую очередь степенью очистки воды и стандартно­ стью отдельных компонентов. Высокое качество воды является наиболее важ­ ным требованием, предъявляемым к компонентам питательной среды. Для при­ готовления питательных сред питьевую воду обрабатывают следующим обра­ зом: 1 ) очищают от органических материалов ультрафильтрацией или обрат­ ным осмосом; 2 ) проводят деминерализацию ионообменным способом или дис­ тилляцией; 3) хранят при 80-90 °С для предотвращения бактериального роста. Среды должны быть приготовлены из реактивов наивысшей чистоты.

По количеству компонентов все питательные среды можно разделить на простые и сложные. Уменьшение числа компонентов до минимума, необходи­ мого для обеспечения роста клеток, привело к созданию так называемых мини­ мальных сред, к которым относится среда, предложенная Иглом. Она является наиболее простой. В ее состав входят 13 аминокислот, 8 витаминов, глюкоза и 6

неорганических солей. Набор 13 аминокислот, входящий в состав среды Игла, считается минимальным для большинства культур клеток млекопитающих. Кроме среды Игла, на практике широко применят среды 199, DМЕМ, RPMI1604 F-2, которые различаются между собой по качественному составу. Для массового культивирования клеток часто применяют среду 199. В состав этой весьма сложной среды входят почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеиновых кислот. Дополнительные факторы роста, ис­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

точники липидов и неорганические соли. Дополненная сывороткой, она может поддерживать рост диплоидных клеток длительный период, а размножение по­ стоянных клеточных линий - неограниченное время. При работе с "капризны­ ми" культурами клеток, а также первичными культурами лейкоцитов и линия­ ми лимфобластоидных клеток предпочитают пользоваться средой RPMI-1604 с сывороткой. Культуры гибридных клеток, как правило, выращивают в среде RPMI-1604 или модифицированной среде Игла, дополненных эмбриональной сывороткой.

Сыворотка содержит более 1000 различных белков и других веществ. Она является поставщиком ряда незаменимых низкомолекулярных питательных ве­ ществ, в том числе пептидных факторов роста и гормонов, является носителем лабильных и водонерастворимых питательных веществ, факторов адгезии, инги­ биторов протеаз и токсинов, повышает буферность и вязкость среды. К недос­ таткам сыворотки относят: вариабельность состава (отдельные серии не облада­ ют достаточной питательной ценностью и даже токсичны); частая контаминация вирусами, микоплазмами, бактериями и грибами; ее присутствие затрудняет оценку питательной ценности среды как таковой и очистку конечного продукта; высокая стоимость и периодическая дефицитность. Сыворотка часто содержит антитела и специфические ингибиторы вирусной репликации. Очень трудно по­ лучить большое количество сыворотки постоянного качества и постоянного со­ става, особенно эмбриональной. Для обогащения питательных сред используют сыворотки различного происхождения. Наиболее широко применяют сыворотку крупного рогатого скота.

Обычно пользуются нативными или инактивированными сыворотками. Тепловая инактивация (56°С, 30 мин) разрушает комплемент, а также случайно попавшие микоплазмы и некоторые вирусы, это снижает и ростовые качества сыворотки, одновременно повышая стабильность при хранении. Непрогретая сыворотка менее стабильна, и ее следует хранить при (- 20)°С.

Кроме сыворотки, к числу природных ингедиентов сред относят различ­ ные белковые гидролизаты, которые являются источником аминокислот и дру­ гих идентифицированных факторов роста клеток. К наиболее известным и рас­ пространенным из них относится гидролизат лактальбумина, получаемый при ферментативном гидролизе белка молока. Среду, состоящую из солевого рас­ твора (Хенкса или Эрла), гидролизата лактальбумина (обычно 0,5%) и сыворот­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ки крови (5-10%) успешно используют для выращивания первичных культур различных тканей млекопитающих.

С целью сведения к минимуму возможности контаминации клеточных культур и сохранения максимального ростового потенциала клеток при массо­ вом культивировании применяют различные методы контроля.

Среда, сыворотка, растворы антибиотиков, трипсина, применяемые до­ бавки должны быть проверены на загрязненность бактериями, микоплазмами и вирусами. Среду и сыворотку, кроме того, проверяют на осмолярность, пирогенность и ростовые свойства. Желательно, чтобы ростовая среда перед стери­ лизацией и хранением не включала сыворотку и глютамины. Ростовую среду хранят на холоде до завершения контроля. Хорошим контролем стерильности ростовой среды является хранение при комнатной температуре без антибиоти­ ков параллельно с проверкой на ростовые свойства и присутствие микоплазм. Ростовую среду на загрязненность микоплазмами обычно проверяют путем 4-х кратного пассирования контрольных клеток в новой среде, а затем клетки ис­ следуют на наличие микоплазм.

Одной из наиболее ответственных стадий в приготовлении сред является стерилизация. Термостабильные среды стерилизуют автоклавированием. Этот метод дешев и при соблюдении условий очень эффективен. В результате авто­ клавирования среда может несколько измениться, но эти изменения не всегда вызывают нежелательный эффект. При стерилизации сред паром под давлени­ ем, возможно, происходит частичное разрушение органических компонентов. Однако, это может компенсироваться за счет образования комплексов, полез­ ных для роста клеток. Термолабильные компоненты среды (сыворотка, бикар­ бонат натрия, глютамин и др.) стерилизуют фильтрованием и добавляют перед использованием среды. Несмотря на положительный опыт применения авто­ клавированных сред, многие исследователи для стерилизации предпочитают пользоваться фильтрованием через стерилизующие мембранные фильтры.

Из-за ограничений при хранении жидких сред все большее внимание привлекают среды, изготовляемые в виде сухих порошков. В настоящее время сухие среды готовят смешиванием компонентов с помощью шаровых мельниц. После растворения сухие порошковые среды поддерживают рост клеточных культур не хуже, чем среды, приготовленные традиционным способом.

Дезагрегация тканей и приготовление однослойных первичных культур клеток. Первичные культуры клеток широко применяют при выделе­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

нии и культивировании вирусов, разработке средств, методов диагностики и специфической профилактики вирусных болезней и получении биологически активных веществ, а также в изучении биологии клеток.

Первичные культуры из нормальных тканей безопасны в онкогенном от­ ношении и в ряде случаев обладают более высокой чувствительностью к виру­ сам по сравнению с клеточными линиями. В настоящее время, несмотря на имеющиеся недостатки (необходимость постоянно иметь источники тканей, особенно для крупномасштабного культивирования, относительная трудность процессов приготовления и возможная контаминация вирусными и другими агентами), их продолжают широко использовать для получения противовирус­ ных препаратов и биологически активных веществ в медицине и ветеринарии.

Приготовление первичных культур клеток включает: получение ткани, выделение клеток, выращивание однослойной культуры.

Выбор источника и отбор ткани. Для получения первичных культур клеток используют различные ткани эмбрионов и животных постнатального периода. Чаще всего это ткани и органы эмбрионов или молодых животных. Эмбриональные ткани имеют ряд преимуществ перед тканями взрослых жи­ вотных. Риск контаминации культур клеток вирусами и другими агентами све­ ден к минимуму, они легче подвергаются дезагрегации, а клетки лучше при­ крепляются к субстрату и обладают высокой потенцией к размножению и при оптимальных условиях начинают делиться уже в первые сутки, быстро форми­ руют монослой, тогда как многие ткани взрослых животных растут в этих усло­ виях более медленно.

Для приготовления первичных культур в вирусологической практике ча­ ще используют ткани почек и реже - других органов. Кроме того, широкое применение получили первичные культуры клеток куриных эмбрионов.

Извлеченные из организма органы и ткани помещают в стерильные сосу­ ды с охлажденными (4-10°С) солевыми растворами, содержащими антибиотики (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл гентамицина, или 1 0 0 мкг/мл канамицина), в некоторых случаях добавляют фунгицидные препараты (нистатин, фунгизон).

Перед дезагрегацией ткани механически измельчают. Период времени между взятием ткани и ее дезагрегацией должен быть минимальным. При необ­ ходимости измельченную ткань можно хранить в охлажденном солевом рас­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

творе или питательной среде, однако, при этом выход жизнеспособных клеток существенно снижается: через сутки - на 10-21%, через 2-3 суток - на 30-50%.

Дезагрегация тканей. Поскольку в тканях межклеточные взаимодейст­ вия в основном обусловлены белками и двухвалентными катионами, для дезаг­ регации тканей и выделения клеток используют соответственно протеолитиче­ ские ферменты и хелатные агенты, а также их соединения.

Ферменты для дезагрегации тканей. Для выделения клеток обычно ис­ пользуют трипсин и реже - другие ферменты.

Трипсин (0,1% - 0,3%) - протеолитический фермент поджелудочной же­ лезы. Наибольшая активность проявляется при рН 8,0. Порошковый коммерче­ ский препарат трипсина, применяемый для выделения клеток в виде растворов, представляет собой фактически смесь протеаз, нуклеаз, липаз и полисахаридов. Рабочий раствор готовят, растворяя трипсин в сбалансированном солевом рас­ творе при рН 7,2-7,6. Растворы трипсина или других ферментов стерилизуют фильтрованием, используя с этой целью мембранные фильтры (диаметр пор 0,2-0,45 мкм).

При использовании высоких концентраций и длительной экспозиции с тканями трипсин повреждает мембраны и разрушает клетки. Для прекращения действия фермента на диссоциируемую ткань применяют сыворотку крови. Она содержит ингибиторы трипсина, которые быстро его нейтрализуют.

Коллагеназа (0,01% - 0,15%) - специфический фермент, способный раз­ рушать коллаген. В частности, одна из коллагеназ микробного происхождения гидролизует в коллагене связи между пролином и другими аминокислотами и действует, прежде всего, на межклеточный матрикс и меньше - на клеточную мембрану.

Проназа (0,25 - 0,5%) - коммерческий препарат, содержащий группу ферментов Streptomyces griseus. Она по сравнению с любой из протеаз обладает более широкой субстратной специфичностью, действуя быстрее, и лучше раз­ деляет ткани на отдельные клетки, чем трипсин. Выделенные клетки обладают выраженной адгезивной и пролиферативной способностью.

Для дезагрегации тканей иногда применяют различные сочетания фер­ ментов: смесь трипсина и коллагеназы, трипсина и проназы.

Хелатные агенты (версен, цитрат натрия, глицерофосфат и др.) - веще­ ства, связывающие двухвалентные катионы и тем самым разрушающие меж­ клеточные связи, применяют для выделения клеток из тканей. Действие их по

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

сравнению с протеолитическими ферментами менее эффективно. Однако хе­ латные вещества являются перспективными, так как имеют стандартный состав и активность, не содержат биологических контаминантов. В отличие от протео­ литических ферментов эти вещества не инактивируются сывороткой.

Методы дезагрегации тканей. Механическую дезагрегацию тканей при­ меняют редко. Их можно дезагрегировать с помощью режущих инструментов гомогенизатора, вибрационной установки или продавливанием через механиче­ скую сетку. Измельчение ткани при помощи острых инструментов обычно предшествует обработке ферментами и хелатными веществами. Ферменты про­ никают в неповрежденную ткань по мере переваривания межклеточного веще­ ства. Даже такие низкомолекулярные вещества, как версен и натрия цитрат, проникают в ткань сравнительно медленно. Для увеличения поверхности кон­ такта диспергирующего раствора с субстратом пользуются методом механиче­ ского измельчения ткани. Перемешивание измельченной ткани в процессе де­ загрегации также значительно ускоряет выделение клеток.

Несмотря на применение различных способов и ферментов для диссоциа­ ции тканей, трипсинизация остается общепринятым методом, хотя и имеет ряд отрицательных свойств (слабое и недостаточно полное переваривание ткани, частое образование слизистого осадка).

Метод тепловой трипсинизации. К измельченной и промытой ткани до­ бавляют 0,25%-ный раствор трипсина (рН 7,2-7,6) в соотношении 1:3 - 1:10 и перемешивают на магнитной мешалке. Температура используемого раствора трипсина может варьировать от комнатной до 37°С. Скорость перемешивания ткани подбирают как, чтобы не было вспенивания и разбрызгивания жидкости. Каждые 10-30 мин раствор трипсина с клетками сливают, а к оставшейся ткани добавляют свежую порцию трипсина. Циклы трипсинизации повторяют не­ сколько раз до полного истощения ткани (дробный метод).

Первый слив раствора трипсина обычно не используют, так как в нем со­ держится большое количество поврежденных клеток и эритроциты. Получен­ ную суспензию клеток (второго и последующих сборов) центрифугируют 1 0

мин, предварительно добавив 2-4% сыворотки для нейтрализации трипсина. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку клеток добавляют ростовую сре­ ду, ресуспендируют и фильтруют через 2-4 слоя марли. После фильтрации оп­ ределяют концентрацию клеток, разбавляют суспензию до необходимой кон­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

центрации ростовой среды и рассевают в культуральные сосуды).

Метод холодовой трипсинизации заключается в том, что после первой экстракции клеток к ткани добавляют свежую порцию раствора трипсина, ох­ лажденного до 4°С, и перемешивают на магнитной мешалке в течение ночи при температуре 4-8°С. В результате такой обработки происходит практически полная дезагрегация ткани.

Выращивание однослойных первичных культур. Культуры клеток вы­ ращивают обычно в специальной культуральной стеклянной или пластиковой посуде, предназначенной для роста клеток в монослое. После эксплантации кле­ ток на стекле наблюдается период покоя, в течение которого клетки прикрепля­ ются к субстрату, распластываются на его поверхности, адаптируются к услови­ ям существования и готовятся к делению. Затем начинается фаза размножения клеток (фаза логарифмического роста). Размножаясь, клетки размещаются в один слой на поверхности субстрата и при полном покрытии его контактируют между собой и прекращают деление (стационарная фаза). Клетки монослоя мо­ гут сохранить жизнеспособность до 2 0 дней и более (в зависимости от вида кле­ ток и состава питательной среды). Затем наступает старение и гибель клеток. Скорость размножения клеток в культуре зависит от вида исходной ткани, воз­ раста животного, качества и рН среды, количества клеток, температуры культи­ вирования, а также от степени повреждения в момент выделения из ткани.

Однослойные культуры можно получить только при посеве определенного количества клеток на единицу поверхности сосуда. Недостаточное и чрезмерное количество клеток тормозит рост культуры. Для культур клеток из разных тка­ ней оптимальная посевная концентрация клеток находится в пределах 2-5 105/мл.

Основные системы промышленного культивирования клеток животных

Системы массового культивирования клеток животных раньше технологи­ чески применялись лишь в производстве вакцин (в первую очередь противо­ ящурных) и интерферона. Существенные изменения технологии массового куль­ тивирования клеток теперь обусловлены широким внедрением постоянных ли­ ний клеток (в том числе с клонированным ДНК) в биотехнологических процес­ сах. Тип клеток-продуцентов и требования, предъявляемые к конечному продук­ ту, являются главными факторами и при выборе промышленной технологии.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

С инженерной точки зрения культуры, в которых клетки окружены жид­ кой средой, считают глубинными. Принципы техники глубинного культивиро­ вания обычно применимы к типам клеток животных, которые растут на по­ верхности твердого субстрата и в суспензии.

Различают статические и динамические системы глубинного культиви­ рования. Первые характеризуются отсутствием перемещения культуральных сосудов и их содержимого в процессе культивирования (пробирки, флаконы, матрасы, многоярусные поддоны, статические суспензии). Под вторым подра­ зумевают движение культуральных сосудов (вращающиеся пробирки, бутыли, "колонны" со стеклянными трубками, многопластинчатые культиваторы) или питательной среды в процессе выращивания (многопластинчатые культивато­ ры, культиваторы с различными наполнителями: бусы, мембраны, диски, мик­ роносители и перемешиваемые суспензии). Системы статического глубинного культивирования применяют при небольших объемах культуральных сосудов.

При промышленном культивировании клеток животных различают мно­ гоэлементные процессы и процессы в единичном оборудовании. Первое назва­ ние относится к системам, увеличение производительности которых достигает­ ся путем простого увеличения числа культуральных сосудов.

Расширение масштабов производства за счет культивирования в единич­ ном оборудовании достигается увеличением размеров культуральных сосудов (культиваторов) без заметного прироста их количества. При этом геометриче­ ское подобие культуральных сосудов, как правило, изменяется.

Увеличение масштаба производства путем увеличения количества одно­ типных культуральных сосудов является практическим методом многократного повторения, тогда как масштабирование, сопровождающееся изменение разме­ ров установки, считается технологическим методом. Наилучшей системой для масштабирования и оптимизации условий культивирования является суспензи­ онная культура.

Клетки, рост которых зависит от прикрепления к поверхности плотного субстрата, можно выращивать в трех типах систем единичного оборудования:

1. Система статических плоскостенных сосудов, эволюционирующая в установки, содержащие множество пластин, расположенных параллельно (рис. 14.9). Эти пластины могут быть статичными или подвижными.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

8

Рис. 14.9. Схема многопластинчатого культиватора:

1-основание; 2-дно; 3 -ж елобки ;4 -стягиваю щ ий стерж ень; 5-опорная гайка; 6 -гайка опорной стойки; 7-кры ш ка; 8-гайка; 9-отверстие для отвода газовой смеси; 10-отверстие для подачи газовой смеси; 11-кольцевая прокладка; 12 -цилиндрический сосуд; 13-стеклянны е пластины ; 14-ам ортизатор; 15-воздуш ны й насос; 16-трубка для подачи образцов; 17-трубка для подачи воздуха; 18-культуральная среда; 19-кры ш ка опорной стойки.

2.Система вращающихся емкостей, преобразовавшаяся в ряд культивато­ ров, содержащих массу трубок и функционирующих аналогично исходной сис­ теме единичного оборудования.

3.Основана на выращивании клеток в культиваторах на пластиковых пленках. Кроме того, известны еще две дополнительные системы. Одна из них предполагает выращивание клеток на внешней или внутренней поверхности синтетических микрокапилляров - полых волокон (наружный диаметр 300 мкм), уложенных в виде параллельно ориентированных слоев. Другая пред­ ставляет собой культиватор, заполненный насадочными элементами (стеклян­ ные бусы, кольца, губки, и т.п.), размер и форма которых широко варьирует (рис. 14.10).

Различают замкнутые (циклические) и открытые системы культивирова­ ния. В замкнутых системах концентрация питательных веществ по мере куль­ тивирования снижается и накапливаются продукты метаболизма. Открытые ха­ рактеризуются непрерывным или периодическим обновлением среды.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

4

Рис. 14.10. Схема реактора насадочного типа (в качестве элементов на­

садки использованы стеклянные шарики):

Культивирование клеток на плотных поверхностях. Для роста боль­ шинства культур клеток необходима твердая поверхность, где клетки прикреп­ ляются и размножаются. Такие клетки принято называть поверхностноили субстрат-зависимыми. К ним относят первичные культуры клеток, линии дип­ лоидных клеток и большинство постоянных клеточных линий.

Для поддержания роста клеток в качестве плотного субстрата используют различные вещества, в том числе стекло, сталь, титан, различные пластики (по­ листирол, меланекс, поликарбонаты), углеводные полимеры (целофан, сефадекс) и др. Многие из них перед применением покрывают сывороткой, белком или полимерами.

Рост поверхностно-зависимых клеток в любых культуральных системах происходит только после их прикрепления к твердому субстрату. Процесс при­ крепления многоступенчатый и включает: адсорбцию факторов прикрепления на культуральной поверхности, контакт с ней клеток, прикрепление и распла­ стывание клеток на культуральной поверхности. Прикрепление клеток связано с двухвалентными катионами и гликопротеинами, адсорбированными на куль­ туральной поверхности, которая должна быть гидрофильной. Если белок и двухвалентные катионы отсутствуют, клетки прикрепляются к культуральной