3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

культуры (оценка РНК, АТФ и др.) Имеется большое количество промышлен­ ных приборных средств, обеспечивающих измерение основных физических па­ раметров с требуемой точностью. Расход входных и выходных потоков контро­ лируется из уравнения материального баланса.

Из химических параметров наиболее удобным является водородный по­ казатель. Промышленные рН метры в настоящее время позволяют выполнять высокочастотные измерения с надежностью 98%.

Для анализа содержания растворенного кислорода обычно пользуются датчиками, содержащими два электрода в электролите, отделенном от потока биосуспензии мембраной из сополимера этилена и пропилена. Недостаток та­ кого датчика, как и любого мембранного, заключается в возможности механи­ ческого повреждения и загрязнения мембраны. Мембранные датчики исполь­ зуются также для измерения растворенного СО2.

Для определения концентрации кислорода в потоке отходящих газов применяются парамагнитные анализаторы. Минимальная погрешность измере­ ний (3%) достигается использованием двух парамагнитных датчиков, установ­ ленных в термостатическом сосуде. На один из датчиков подается поток эта­ лонного газа. За рубежом применяются полярографические датчики кислорода. Содержание СО2 в потоке отходящих газов определяется по величине погло­ щения инфракрасного светового пучка и методами масс-спектроскопии.

Биологические параметры наиболее трудно поддаются измерению, по­ скольку они, в основном, определяются в ходе сложных биохимических реакций. Поэтому для оценки биологических параметров используются косвенные харак­ теристики: вязкость биомассы, оптическая плотность, мутность и др. Для опре­ деления концентрации биомассы используют капиллярный вискозиметр с пред­ варительным подогревом и периодической калибровкой эталонным раствором.

Для определения концентрации одноклеточных организмов в культу­ ральной жидкости успешно используются оптические устройства. В частности датчик, позволяющий производить непрерывное измерение оптической плотно­ сти биосуспензии в реальном масштабе времени. Отличительной особенностью прибора является возможность автоматического разбавления биомассы с по­ мощью специальной цилиндрической кюветы, содержащей прозрачную трубку с дистиллированной водой. Для измерения диапазона измеряемых концентра­ ций имеется набор съемных кювет. Такие датчики используют для измерения концентрации лимонной кислоты.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Для измерения мутности биосуспензий в ферментаторе устанавливают зеркало, на которое падает световой пучок, переданный от источника света по световому волокну. Отраженный световой пучок поступает на фотоэлемент. Для увеличения точности измерений оценка концентрации производится по разностному сигналу, полученному при различных смещениях зеркала.

Широкое распространение получили датчики концентрации биомассы, основанные на измерении электрических свойств биосуспензии. Принцип рабо­ ты датчика основан на измерении проводимости суспензии микроорганизмов. Недостатком указанных датчиков является невозможность проведения измере­ ния непосредственно в биореакторе. Для устранения этого недостатка предло­ жено использовать датчик, состоящий из двух помещенных в ферментер ци­ линдров, внутри которых имеются электроды.

Одним из наиболее перспективных направлений в области разработки контрольно измерительной аппаратуры для управления биосинтезом является создание датчиков с чувствительными элементами, содержащими биологиче­ скиактивное вещество, так называемых биосенсоров и биозондов. Применение для аналитических целей биосенсоров и биозондов на основе иммобилизован­ ных ферментов, а также целых клеток микробного, растительного и животного происхождения позволяет существенно сократить время анализа и открывает возможность полной автоматизации управления и контроля биотехнологиче­ скими процессами. Использование биосенсоров и биозондов наиболее эффек­ тивно в ферментативной технологии, клинической биохимии.

Принцип работы биозондов основан на специфических реакциях, в кото­ рых участвует биологически активное вещество чувствительного элемента (в качестве биологически активного вещества используют ферменты, многофер­ ментные системы, антитела, органеллы, бактериальные клетки, участки тка­ ней), непосредственно связанное с преобразователем. В результате реакций из­ меняются один или несколько физико-химических параметров (выделение или поглощение газов О2, СО2, NH3, выделение тепла, изменение электропроводно­ сти) и преобразователем вырабатывается соответствующий электрический сиг­ нал. Биосенсоры могут разрабатываться на основе любой ферментативной ре­ акции, сопровождающейся изменением рН, концентрацииО2, СО2, выделением тепла, излучением света и др.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

14.2.2. Культивирование клеток и тканей животных и человека

Массовое выращивание клеток животных в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и в первую очередь производства противовирусных препаратов.

Одним из основных свойств клеточных культур является ограниченная даже при условии постоянного переноса их на свежую питательную среду про­ должительность жизни (после 50-100 делений клеточные культуры погибают). Не составляют исключения и такие хорошо переносящие культивирование клетки как фибробласты. Чем моложе возраст источника, из которого получены клетки для культивирования в культуре, тем большее число раз они способны делиться, прежде чем погибнуть. Анэуплоидные клетки (клетки, у которых число хромосом в ядрах не является кратным гаплоидному набору), а также многие линии опухолевых клеток составляют исключение из этого правила.

Клеточные субстраты. В течение многих лет разрабатывались методы выращивания клеток животных в небольших количествах в лабораторных ус­ ловиях. Однако наладить массовое культивирование таких клеток оказалось не просто. Способ выращивания, характер, используемые среды, методы управле­ ния и контроля в значительной степени зависят от типа выращиваемых клеток. Все культивируемые клетки первоначально получают от животных механиче­ ской или ферментативной дезагрегацией. Тканевые эксплантаты или клетки, помещенные в подходящую среду, развиваются в первичные культуры с "нор­ мальным" (диплоидным) или "ненормальным" (трансформированным или про­ исходящим из опухоли) кариотипом.

Классификация культивируемых клеток представляет определенные трудности. Различают первичные культуры клеток и клеточные линии. В про­ изводстве вакцин предпочитают первичные или вторичные культуры; диплоид­ ные клеточные линии и непрерывные (постоянные) клеточные линии.

Первичная культура - это культура, происходящая от клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма. Культура считается первичной до тех пор, пока она не субкультивируется, после чего становится клеточной линией. Постоянная клеточная линия - это клетки, способные субкультивироваться вне организма в течение неограниченного числа пассажей.

Первичные культуры обычно получают трипсинизацией тканей куриных эмбрионов или тканей (чаще всего почек), взятых от других видов здоровых животных. Возраст используемых эмбрионов может значительно различаться и

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

влиять на выход и жизнеспособность клеток.

Первичные культуры значительно различаются в зависимости от типа ткани и условий выращивания. Некоторые культуры после посева через не­ сколько дней погибают, тогда как другие могут длительно сохраняться без за­ метных морфологических и биохимических изменений. С момента приобрете­ ния такими культурами способности расти при серийных пересевах и до гибели в результате потери такой способности проходит от нескольких недель до не­ скольких месяцев. Клетки эмбрионального происхождения обычно сохраняют жизнеспособность при культивировании более продолжительный период.

Факторы, влияющие на культивирование клеток. Клетки теплокров­ ных животных являются наиболее прихотливыми к условиям внешней среды. Кроме питательных веществ, для сохранения жизнеспособности, роста и раз­ множения клеток в культуре, а также для выполнения специфических функций требуются определенные физические и химические условия.

Температура является одним из главных условий нормальной жизнедея­ тельности клеток. К колебаниям температуры особенно чувствительны клетки теплокровных животных. Для нормальных жизненных процессов большинства клеток млекопитающих и птиц оптимальная температура в пределах 36 - 38 °С. Клетки млекопитающих, в отличие от клеток холоднокровных позвоночных и насекомых, имеют более высокий температурный оптимум и несколько хуже хранятся при низких положительных температурах. Крайние температуры об­ ратимости для клеток млекопитающих - 42 °С, а для клеток птиц - 46 °С. Фиб­ робласты оказались более чувствительными к нагреванию, чем эпителиальные клетки. У некоторых клеток млекопитающих, таких как эпителий кожи, темпе­ ратурный оптимум ниже, чем у остальных. Клетки млекопитающих проявляют небольшую способность адаптироваться к повышенной (42,5°С) и пониженной (30°С) температурам. Клетки насекомых хорошо размножаются при 25 °С и в зависимости от индивидуальных особенностей и предшествующей адаптации их оптимум роста может быть при температуре 22-30 °С. Культуры клеток хо­ лоднокровных позвоночных выращивают, как правило, при 20-25 °С.

Осмотическое давление среды также является важным фактором, обу­ словливающим нормальную жизнедеятельность клеток животных в культуре. Определяется оно числом молей осмотически активных частиц (ионов и неио­ низированных молекул), содержащихся в 1 л раствора (осмолярность). В пита-

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

тельных средах, как и в жидкостях животного организма, оно определяется главным образом концентрацией неорганических солей и, в первую очередь, хлористого натрия. Однако, органические вещества, особенно низкомолекуляр­ ные, например глюкоза, также влияют на осмотическое давление среды. Для клеток млекопитающих нормальное осмотическое давление при 38 °С равно 770 кПа, что cooтветствует точке замерзания около (- 0,63) °С. Клетки легко переносят колебания осмотического давления в пределах ±1 0 %.

Концентрация водородных ионов играет исключительную роль в обеспе­ чении нормального метаболизма клеток. При культивировании клеток млеко­ питающих и птиц стремятся поддерживать рН среды близким к нейтральному (7,0-7,2), хотя клетки остаются жизнеспособными длительный период при рН 6,8-7,8. Наиболее стойки к изменению рН однослойные культуры клеток. Клет­ ки, растущие в суспензии, весьма чувствительны к отклонению рН за пределы границ оптимального роста. Это объясняется, вероятно, тем, что в однослойной постоянной культуре клетки создают на своей поверхности "микроклимат", ко­ торый несколько отличается от окружающей питательной среды, в том числе и по величине рН. В постоянно перемешиваемой суспензии условия везде одина­ ковы: как в околоклеточном пространстве, так и вне его. Доказано, что опти­ мальный показатель рН среды неодинаков для различных клеточных культур. Для максимального размножения целого ряда перевиваемых клеток оптималь­ ный рН среды является индивидуальным. В целом клетки постоянных линий по сравнению с ^трансформированными предпочитают менее щелочной рН.

Газовая среда. Растворенный кислород имеет ключевое значение в мета­ болизме клеток. Кислород и углекислота, как и вода, свободно проникают в клетку и выходят из нее по градиенту концентрации. Интенсивность дыхания (потребление кислорода на клетку в единицу времени при определенных тем­ пературах и давлении) зависит от вида клеточной культуры. Оптимальный уро­ вень растворенного кислорода для различных линий клеток является неодина­ ковым и варьирует от 1 0 до 1 0 0 % насыщения воздухом.

Потребность в питательных веществах. Клетки животных в культуре сохраняют ту же потребность в питательных веществах и ростовых факторах, что и в организме. Создание условий культивирования, адекватных имеющимся в организме, является важной и в то же время трудной задачей. Требования клеток к факторам среды в значительной мере зависят от типа и свойств куль­ туры. Различают два основных компонента питательных сред: низкомолеку­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

лярные соединения (метаболиты, витамины, ионы) и ростовые факторы. В сы­ вороточных средах источником ростовых факторов и многих минорных компо­ нентов является сыворотка крови животных.

Неорганические соли. Потребности клеток в неорганических солях в культуре и в организме практически совпадают. Главными ионами среды явля­ ются Na , K , Са , Mg , C1, НРО4 ". Неорганические соли в основном обеспе­ чивают поддержание электролитического баланса и осмотического равновесия среды. Кроме того, ноны могут действовать как регуляторы роста или различ­ ных функций клеток. Ионы калия, например, играют важную роль в росте вы­ сокодифференцированных клеток сердца, глин и гонад, а ионы кальция - в ре­ гуляции митозов. Соотношение ионов Са и Mg важно для контроля клеточной пролиферации и трансформации in vitro. Кроме участия в обмене, кальций иг­ рает определенную роль в прикреплении клеток к стеклу и другим плотным субстратам в процессе культивирования на поверхностях. При культивирова­ нии в суспензии с целью уменьшения прикрепления клеток друг к другу и стенкам культуральных сосудов в среду не включают солей кальция, а потреб­ ность клеток в этом ионе, вероятно, удовлетворяется за счет его присутствия в сыворотке. Бикарбонат обычно включают в среды не только как питательное вещество, но и как буфер. Урожай клеток и скорость их роста зависят от соот­ ношения различных ионов, особенно ионов натрия и калия. Иногда в состав пи­ тательных сред включают микроэлементы. Такие элементы, как Fe, Cu, Zn, Co, Мо, в течение многих лет входят в состав некоторых сред. Среди других полез­ ных следовых элементов, обладающих активностью in vitro, отмечены Se, S, V, Cr, Al и As.

Аминокислоты. Все среды содержат аминокислоты, но количество их и соотношение варьирует в широких пределах. Аминокислоты необходимы как строительные блоки белкового синтеза, а также как источник энергии. Для рос­ та и размножения широкого спектра клеток млекопитающих требуются по меньшей мере 13 аминокислот. Кроме 8 аминокислот, необходимых организму (изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан и валин), клет­ ки млекопитающих для размножения в культуре нуждаются еще в пяти амино­ кислотах: аргинине, цистине, глютамине, гистидине и тирозине. Некоторые не­ обходимые аминокислоты (гистидин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилала­ нин, тирозин, валин) могут быть заменены соответствующими кетокислотами, которые с помощью различных клеточных трансаминаз превращаются в ами­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

нокислоты, подобно тому, как это происходит в организме. Необходимость присутствия в среде пяти аминокислот, не требующихся для целого организма, вызвана различными причинами и связана, прежде всего, с их ограниченным синтезом клетками как в организме, так и в культуре.

Витамины. Для роста в культуре клетки нуждаются в восьми витаминах группы В: никотинамиде, тиамине, пантотенате, пиридоксине, рибофлавине, фолиевой кислоте, холине и инозитоле. Большинство из них являются кофакто­ рами энзимов. Клетки растут с максимальной скоростью, если концентрация этих витаминов в среде не ниже 10 -10 г/мл. В состав многих сывороточных сред не входит биотин. Однако при культивировании диплоидных фибробла­ стов человека его присутствие в среде необходимо .

Витамин С, стабильный лишь в кислых растворах, включают в некоторые среды преимущественно для обеспечения окислительно-восстановительного потенциала, например, вместе с глютатионом и цистеином.

Жирорастворимые витамины в последнее время, как правило, не вклю­ чают в состав питательных сред. Однако витамин А и его аналоги имеют важ­ ное значение для дифференциации клеток и стабильности мембран. Витамин Е используют, в основном, как антиоксидант.

Углеводы. При обычных условиях выращивания клетки получают энер­ гию главным образом за счет гликолиза углеводов. Хотя энергетическая по­ требность клеток обеспечивается в определенной степени за счет аминокислот

иа -кетокислот они не могут заменить углеводы.

Всыворотке крови взрослых животных основным углеводом является глюкоза, а эмбрионов млекопитающих - фруктоза. В качестве энергетического материала для культивирования клеток чаще всего используют глюкозу. Глю­ козу более или менее эффективно можно заменять другими углеводами (фрук­ тозой, лактозой, галактозой, маннозой и мальтозой). Диплоидные клетки чело­ века приблизительно в одинаковой степени утилизируют глюкозу, маннозу и в меньшей степени - фруктозу и галактозу.

Липиды. При обычных условиях культивирования клетки содержат не­ большое количество липидов. Большинству нетрансформированных клеток требуются жирные кислоты. Многие синтетические среды не содержат липи­ дов, и культивируемые в них клетки обеспечивают свою потребность главным образом за счет липидов сыворотки. Жирные кислоты, стероиды, фосфолипиды и многие другие метаболиты попадают в сывороточные среды с сывороточны­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ми белками, которые могут связывать их в высоком соотношении (например, с бычьим сывороточным альбумином 9:1). Поэтому сыворотка является прекрас­ ным источником липидов для культивирования клеток в минимальной среде, не содержащей липидов. Белки сыворотки, с одной стороны, могут освобождать в среду полезные жирные кислоты, а с другой - связывать образующиеся в куль­ туре и являющиеся ингибиторами роста клетки. Жирные кислоты могут посту­ пать в связанной форме с бычьим сывороточным альбумином (олеиновая ки­ слота) или с диализованной эмбриональной сывороткой (линолевая кислота).

Гормоны и факторы роста. Все клетки в культуре нуждаются во многих гормонах и ростовых факторах, которые обеспечивают прохождения клеточно­ го цикла и синтетических процессов. Обычно для выращивания эпителиальных клеток в бессывороточные среды включают инсулин, выполняющий многие функции, и кортизол или его синтетический аналог дексаметазон. Многие бес­ сывороточные среды содержат 1 0 факторов роста и гормонов, в том числе трансферрин, связывающий железо, и кроме того, бычий сывороточный альбу­ мин, связывающий жирные кислоты.

К ростовым факторам относят вещества, как правило, пептидной приро­ ды, обладающие способностью стимулировать пролиферацию клеток непосред­ ственно или в совокупности с другими факторами. Факторами роста называют белки, которые индуцируют пролиферацию, находясь вне клетки и взаимодей­ ствуя с ее поверхностью. Прототипом этой группы молекул является фактор роста из тромбоцитов. В нее также входят эпидермальный фактор роста, а- и b-

трансформирующие факторы роста, фактор роста фибробластов, инсулин, соматомедины (инсулиноподобные факторы роста), трансферрин и др. Их дейст­ вие имеет обратимый характер. Они не обладают специфической мутагенной активностью. В физиологических условиях синтезируются нормальными клет­ ками. Например, основным источником эпидермального фактора роста являют­ ся слюнные железы.

Питательные среды и солевые растворы. Питательные среды должны обеспечивать необходимые для роста клеток физико-химические условия и снаб­ жать их питательными веществами для синтеза клеточной биомассы и продуктов.

Успех приготовления клеточных культур зависит от качества материалов, содержащихся в питательной среде и вносимых при посеве. По количеству и качеству компонентов питательные среды для тканевых культур значительно различаются между собой. Они могут состоять из компонентов, химический со­