3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

поверхности непрочно, только за счет неспецифической адсорбции.

Наиболее оптимальным методом культивирования клеток на твердых по­ верхностях, является культивирование с использованием микроносителей. Этот метод был предложен в 1961 г Ван-Везелем. Гранулы микроносителя изготав­ ливают из природного полимера глюкозы - декстрана или какого-либо синте­ тического полимера. Диаметр их от 50 мкм до нескольких сотен микрометров.

Микроносители суспендируют в питательной среде. Затем добавляют клетки, которые прикрепляются к микроносителю, размножаются и покрывают всю поверхность гранул. Поскольку клетки растут на поверхности гранул, взвешенных в толще жидкой питательной среды, система на микроносителях, по сути, представляет собой суспензионную культуру. Этот метод наиболее полно отвечает требованиям крупномасштабного культивирования поверхно­ стно-зависимых клеток, обеспечивает равномерные условия культивирования, контроль основных параметров среды, визуальное наблюдение за ростом кле­ ток и высокую производительность.

Основные требования, предъявляемые к микроносителям следующие: по­ верхность их должна нести умеренно положительный заряд; в разных партиях микроносителя не должно быть колебаний в плотности заряда. Плотность ве­ щества, из которого изготовлены микрогранулы, должна быть в пределах 1 ,0 2 ­

1,04 г/см . В этом случае они легко поддерживаются в суспензии при неболь­ шой скорости перемешивания.

Для того, чтобы снять выросшие клетки с микрогранул с целью дальней­ шего пассирования или использования, применяют протеолитические фермен­ ты (трипсин, проназу, коллагеназу), механические способы или сочетают оба метода. Клетки, выросшие на микроносителях, хорошо сохраняются на микро­ гранулах в замороженном состоянии при температуре жидкого азота. После от­ таивания они остаются прикрепленными, что облегчает адаптацию к нормаль­ ным условиям при размножении.

Культивирование клеток в суспензии. В суспензионной культуре спо­ собны размножаться только постоянные клеточные линии и то, как правило, после адаптации к условиям культивирования. Большинство из них относится к «ненормальному» типу клеток.

Суспензионные культуры готовят из однослойных в фазе логарифмиче­ ского роста. Клетки осторожно отделяют от стекла с помощью диспергирую­ щих растворов или реже - механическим способом. С целью предотвращения

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

агрегации клеток и прикрепления их к стеклу на верхней границе жидкости, приводящей в конечном счете к гибели культуры, в среду добавляют кристал­ лический трипсин в концентрации 10-50 мкг/л.

После адаптации клеточной линии к росту в суспензии и соблюдении стандартных условий выращивания клетки размножаются практически с посто­ янной скоростью.

Культуры клеток - продуценты интерферона. Способностью к био­ синтезу интерферона обладают клетки всех позвоночных животных. Различают три класса интерферонов: лейкоцитарный или а-интерферон, получаемый в культуре лейкоцитов, которые для этой цели выделяют из крови доноров; фибробластный или в-интерферон, для получения которого используют культуру куриных фибробластов; иммунный или у-интерферон, биосинтез которого осу­ ществляется в сенсибилизированных Т-лимфоцитах при повторном контакте с митогенами, бактериальными и вирусными антигенами, антисыворотками про­ тив поверхностных детерминант лимфоцитов. Все эти классы отличаются один от другого в антигенном отношении, а каждый подразделяется на множество видов (известно 18 видов интерферона). Интерфероны обладают антивирус­ ным, иммуномодулирующим, и антипролиферативным действием. Установле­ но, что у-интерферон обладает значительно более выраженным иммуномодули­ рующим и антипролиферативным действием, чем а и в -интерферон.

В настоящее время интерфероны успешно получают с применением ген­ но-инженерных штаммов E. coli и дрожжей. Методы генной инженерии дают возможность производить интерферон в бактериальных клетках.

Лейкоцитарный интерферон. До недавнего времени источником интерфе­ рона служили главным образом лейкоциты человека (клетки так называемого светлого слоя), выделенные из донорской крови. Процесс получения интерфе­ рона из лейкоцитов выглядит следующим образом: Основным субстратом яв­ ляются белые клетки - лейкоциты периферической крови. Оптимальные усло­ вия для продукции интерферона следующие: большая концентрация лейкоци­ тов во взвеси; множественность инфекции; температура инкубации 37°С; дли­ тельность цикла продукции интерферона - 2 2 часа; концентрация сыворотки человека в среде 5%; рН среды 7,4-7,5.

Для приготовления лейкоцитарной взвеси используют следующий метод. Донорскую кровь получают в консервирующем растворе и сохраняют при 4 °С

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

в течение 18-24 ч. За этот период эритроциты оседают на дне сосуда, над ним в виде пленки, располагаются лейкоциты, а верхний слой состоит из плазмы. Лейкоцитарную пленку извлекают и помещают в отдельный сосуд, куда попа­ дает также некоторое количество эритроцитов и плазмы.

Лейкоцитарную массу обрабатывают 9-10 объемами 0,83% раствора ам­ мония в течение 10 мин. при 4 °С и центифугируют при 1200 об/мин. Целью этих процедур является удаление эритроцитов, которые, с одной стороны ад­ сорбируют вирус-индуктор и снижают его количество, связавшееся с лейкоци­ тами, с другой, разрушаясь под действием вируса, увеличивают содержание в препаратах интерферона белков.

Среда, используемая для поддержания клеток во время продукции интер­ ферона, является средой Игла без фосфатов, содержащей 3 мг/мл трицина, ан­ тибиотики и 4% человеческой сыворотки. Постоянное присутствие сыворотки или белковых компонентов в среде необходимо для достижения высокой про­ дукции интерферона. Оптимальные результаты получают при применении че­ ловеческой сыворотки, гаммаглобулины которой обрабатывают сульфатом ам­ мония и диализом удаляют соли.

Прайминг осуществляют в течение 1-2 часов с использованием 100 ед/мл интерферона. Наилучшие условия для продукции интерферона лейкоцитами создаются при рН 7,3-7,5 и температуре инкубации 36,5-37 °С. Лейкоциты ин­ дуцируют аллантоисными вирусами болезни Ньюкасла или Сендай. После ин­ кубации в течение 20 ч при 37 °С, во время которой принципиальное значение имеет поддержание жизнеспособности культур и высокого метаболизма клеток при постоянстве рН, клетки отделяют центрифугированием (2000 об/мин) в те­ чение 40 мин. Как отмечалось выше, лейкоциты вырабатывают интерферон в ответ на воздействие различными агентами, для лейкоцитов человека наиболее мощными индикаторами являются вирусы болезни Ньюкасла и Сендай. Вирусы гриппа и кори также стимулируют активную выработку интерферона, абровирусы малоэффективны.

Таким образом, получение лейкоцитарного интерферона состоит из сле­ дующих стадий:

1.Выделение лейкоцитов из донорской крови.

2.Прайминг (предварительная обработка лейкоцитов - стимуляция ин­ терферонообразования).

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

3.Индукция лейкоцитов вирусом.

4.Биосинтез (выработка интерферона лейкоцитами).

5.Отделение обработанных лейкоцитов.

Выход интерферона (по активности) от 110 4 до 110 5 ед/мл. Следует от­ метить, что в производстве интерферона используют кровь, отвечающую тре­ бованиям, предъявляемым к отобранным для гемотрансфузии донорам. К мето­ дам получения лейкоцитов относятся осаждение эритроцитов под действием декстрана или поливинилового спирта и гемолиза. В производственных усло­ виях лейкоциты для обработки поступают на следующие сутки после взятия крови от донора. Поэтому особое внимание уделяют стимуляции интерфероно­ образования путем предварительной обработки лейкоцитов - праймингу. Для этого наряду с интерфероном, используют малые дозы инсулина. Необходимо отметить сезонные колебания продукции интерферона лейкоцитами.

14.2.3. Культивирование клеток и тканей растений Как известно, в природных условиях клетки животных и растений нахо­

дятся в тканях и органах и защищены от механического воздействия внешней среды. Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов мине­ ральной и органической природы для метаболизма и роста, поэтому экспери­ менты культивирования этих клеток in vitro в прошлом кончались неудачно. Сначала к минеральным средам добавляли экстракты растений или сыворотку, и лишь в 1922 г. Роббинсу удалось на синтетической среде осуществить рост меристемы кончиков корней томатов и кукурузы.

В настоящее время растительные клетки культивируют, как правило, в виде каллуса. Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных орга­ нов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду (в пробирках, колбах, чашках Петри). В природных условиях каллусная ткань возникает в травмированных местах для анатомической регенерации постра­ давшего органа. От инфекции каллусную ткань в природных условиях защи­ щают иммунные механизмы организма. В искусственных условиях необходимо строго соблюдать стерильность всеми доступными средствами. Обычно экс­ плантат обрабатывают дезинфицирующими растворами, а затем отмывают сте­ рильной водой. Среду, посуду и аппаратуру стерилизуют традиционными сред­ ствами (автоклавирование, ультрафильтрация, облучение). Чтобы обеспечить развитие каллусных клеток в средах, содержащих необходимые для роста ве­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

щества, клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла лис­ та и других тканей должны утратить способность дифференцировки. Недиффе­ ренцированному развитию клеток способствует прединкубация эксплантатов на среде без гормонов в течение 3-6 сут. Через 4-6 недель культивирования трансплантата возникает первичный каллус, который необходимо перенести на свежую питательную среду. При культивировании на агаризованной среде ку­ сочек каллуса, переносимый на свежую среду, должен иметь массу около 60­ 100 мг. Такие кусочки ткани переносят на 30-40 мл свежей среды. Каллусная ткань, выросшая на поверхности твердой питательной среды, имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонкостенных паренхимных клеток. При длительной пересадке каллусные ткани, имеющие первоначальную белую, желтоватую, зеленую или красную пигментацию, могут терять окраску, а структура ткани становится более рыхлой. Химический состав каллусной ткани обычно отличается от состава соответствующего органа растений. Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т.е. начинается их дифференцировка. Этот процесс регулируют гор­ моны.

Клетки растений можно культивировать и глубинным методом в жидкой среде. Для этого необходимо получить линии клеток, образующих небольшие агрегаты (по 5-10 клеток). Для глубинного культивирования более пригодны рыхлые каллусные ткани. Перед пересевом первичную культуру фильтруют че­ рез два слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы отде­ лить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантата. На образова­ ние клеточных агрегатов оказывает также влияние интенсивность перемешива­ ния среды, т.е. степень турбулизации.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганизмов. Время их удвоения 1-3 сут. Процесс культивирования растительных клеток занимает 2-3 нед, что по­ вышает требования к обеспечению асептических условий. В настоящее время методом культивирования растительных клеток получают вещества вторичного метаболизма. Практический интерес представляют алкалоиды, гликозиды, по­ лисахариды терпеноиды, полифенолы, эфирные масла, пигменты, ингибиторы пептидной природы и др.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

14.2.4. Инженерная энзимология (ферментная технология) Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их индустрия за­

родилась в начале ХХ в., и объемы ферментного производства продолжают увеличиваться. Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассор­ тименте - организованным частицам (вирусам). Наука, изучающая ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология - это ветвь биологиче­ ской технологии, изучающая биотехнологические процессы, в которых исполь­ зуется каталитическое действие ферментов.

Основная задача инженерной энзимологии - разработка биотехнологиче­ ских процессов с использованием биокатализаторов. Сюда входит конструиро­ вание ферментов с определенными свойствами (специфичностью, термомтабильностью, кислотостабильностью и т.д.), моделирование ферментных реак­ торов. Основным направлением инженерной энзимологии является применение иммобилизованных ферментов. С использованием методов инженерной энзи­ мологии проводится синтез и модификация органических соединений (амино­ кислот, нуклеозидов, антибиотиков, стероидов и др.), химический и биохими­ ческий анализ (биосенсоры, ферментный и иммуноферментный анализ), полу­ чение фермент-содержащих лекарственных препаратов.

14.3. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИИ

В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации со­ держатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, остатки питатель­ ной среды, пеногаситель и другие растворенные и нерастворенные вещества.

Целевым продуктом биосинтеза могут быть либо непосредственно сами микроорганизмы, либо их метаболиты, растворенные в культуральной жидко­ сти или находящиеся внутри клеток микроорганизмов. Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходимо отделить взвешенную фазу - массу микроорганизмов от культуральной жидкости. Содержание микроорга­ низмов в культуральной жидкости, как правило, очень низкое. Количество биомассы в культуральной жидкости обычно не превышает при аэробном про­ цессе 20-30 г/л, а при анаэробном - 1-5 г/л.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Отделение такого количества взвешенной фазы - трудная технологиче­ ская задача, которую приходится решать путем постепенного концентрирова­ ния биомассы различными способами (фильтрация, флотирование, сепарирова­ ние, упаривание). В производственных условиях приходится затрачивать зна­ чительное количество энергии на обработку больших объемов труднофильт­ руемых суспензий.

Продукты микробного синтеза выпускают в трех основных формах:

-Концентраты - обезвоженная культуральная жидкость, содержащая биомассу (кормовые концентраты аминокислот, витаминов, антибиотиков, не­ очищенные ферментные препараты);

-Обезвоженная микробная биомасса (хлебопекарные дрожжи, бактери­ альные удобрения и др.)

-Технические или очищенные препараты ферментов, антибиотиков, аминокислот и т.д.

В том случае, если БАВ накапливаются внутри клеток, предварительно проводят их разрушение.

Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от куль­ туральной жидкости можно разделить на: механические (отстаивание, фильт­ рование, центрифугирование) и теплотехнические (сушка). В зависимости от препаративной формы, которую необходимо получить, а также свойств целево­ го продукта и перерабатываемой культуральной жидкости или твердофазной культуры, используют те или иные методы концентрирования и выделения

продуктов микробиологического синтеза.

Независимо от типа биосинтеза (внеклеточное или внутриклеточное рас­ положение целевого продукта) первой стадией подготовки культуральной жид­

кости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы - биомассы. На производстве это связано с переработкой больших объемов труд­ нофильтруемых суспензий, значительными потерями целевого продукта, в оп­ ределенной степени влияющими на показатели последующих стадий очистки.

Фракционирование часто осуществляют путем сепарирования, имеющего

ряд преимуществ перед фильтрацией и другими способами, а именно:

1 ) нет необходимости в применении фильтрующих добавок; кроме техно­

логических удобств и экономии это позволяет ненужную для дальнейшей обра­ ботки фракцию использовать в корм животным;

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

2 ) сепарация как более надежный, непрерывный процесс дает возмож­ ность обработать материал с наименьшими потерями активного вещества;

3) процесс легче поддается автоматизации, агрегаты занимают меньше помещений, легче осуществить мойку оборудования.

Фильтрование является менее энергоемким, но одновременно и менее интенсивным процессом по сравнению с сепарированием. Фильтрованию под­ даются далеко не все культуральные жидкости; многие из них имеют свойство быстро закрывать (засорять) поры фильтрующего материала. Иногда специаль­ но меняют культуру, чтобы культуральная жидкость поддавалась фракциони­ рованию фильтрованием.

Для осаждения биомассы перед фильтрацией иногда добавляют флокулянты различной природы. Широко применяются в качестве флокулянтов во­ дорастворимые полимеры как биологического (природного) происхождения, так и синтетические.

Подавляющее большинство синтетических флокулянтов получено поли­ меризацией и сополимеризацией виниловых мономеров - соединений, содер­ жащих легко полимеризующуюся двойную связь и разнообразные функцио­ нальные группы. Среди синтетических неионогенных промышленных флоку­ лянтов как по практическому применению, так и по объему производства ве­ дущее место занимает полиакриламид (ПАА). Это обусловлено его невысокой стоимостью, низкой токсичностью, достаточно высокой эффективностью во многих флокуляционных процессах и др. Акриламид легко полимеризуется и сополимеризуется с большинством виниловых мономеров, что дает возмож­ ность получать флокулянты различной природы с заданными свойствами.

Среди водорастворимых гетероцепных кислородсодержащих полимеров наибольшее практическое значение имеет полиэтиленоксид (ПЭО). Его интен­ сивное использование началось с 50-х годов, когда удалось синтезировать высо­ комолекулярные образцы полимера. ПЭО - кристаллический водорастворимый полимер (смешивается с водой в любых соотношениях) общей формулы: Н-(- ОСН2 СН2 -)п -ОН. В отличие от виниловых карбоцепных полимеров, его полу­ чают в широком интервале молекулярных масс - от олигомеров (полиэтиленгли­ коли) до высокополимеров с молекулярной массой несколько миллионов.

К анионным флокулянтам относятся водорастворимые полимеры, содер­ жание карбоксильные, сульфатные и фосфатные группы. В зависимости от кон­ станты диссоциации ионогенных групп различают сильнокислотные

слабыми поликислотами являются полиакриловая (ПАК), полиметакриловая (ПМАК), альгиновая и другие кислоты. Сильные поликислоты - это полиэти­ ленсульфокислота, полистиролсульфокислота, гепарин и др.

Подавляющее большинство практических задач связано с флокуляцией отрицательно заряженных дисперсий, в том числе и биоколлоидов. В этих слу­ чаях используются катионные флокулянты, которые в зависимости от химиче­ ского состава подразделяют на сильно- и слабоосновные. К слабоосновным флокулянтам относятся полимеры, содержащие в цепи первичные, вторичные и третичные атомы азота, способные протонироваться в водных растворах: поли­ виниламин, полиэтиленамин, поливинилпиридины и др.

Тенденция предпочтительного использования флокулянтов на основе природных полимеров обусловлена их биодеградируемостью и нетоксично­ стью, наличием экономических источников сырья и простых методов модифи­ кации. Природные флокулянты, в отличие от синтетических, получают метода­ ми химической модификации природных полимеров. Наиболее доступными и широко используемыми флокулянтами являются производные целлюлозы.

В качестве оборудования для фильтрования применяют фильтр-прессы различной конструкции, барабанные вакуумные фильтры, ленточные фильтр­ прессы и другие конструкции, например ФПАКМ 5,0 (площадь поверхности фильтрации 5 м2 ), ФПАКМ 2,5 (2,5 м2).

Для улучшения показателей фильтрации в фильтрах периодического дей­ ствия используют вспомогательные фильтрующие материалы (ВФМ), которые на поверхности фильтрации образуют грунтовой фильтрующий слой. При от­ делении биомассы от культуральной жидкости актиномицетов—продуцентов антибиотиков толщина грунтового слоя составляет 2,5 мм, а расход наполни­ теля при максимальной скорости фильтрации - 8 %. Первые 15-20 с процесс со­ ответствует фильтрации с закупориванием пор намывного слоя, а далее проте­ кает по типу фильтрации с накоплением осадка, что резко повышает ее ско­ рость. Правильный выбор режима фильтрации определяет скорость фильтра­ ции, расход фильтровального порошка, влажность мицелиального осадка и со­ ответственно, потери целевого продукта.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

При производстве ферментных препаратов, особенно из бактериальных культур, для фильтрации культуральной жидкости используют ВФМ типа ки­ зельгур (диатомит, инфузорная земля), бентонит, микрозил, фильтроперлит.

Флотация. Этот способ концентрирования микробных суспензий состо­ ит в том, что полученную на стадии ферментации культуральную жидкость вспенивают, при этом большая часть микроорганизмов концентрируется в пен­ ной фракции. Отделяя пену от основной массы жидкости, получают полупро­ дукт с содержанием биомассы в 2-4 раза выше, чем в исходной культуральной жидкости.

Процесс осуществляют в специальных аппаратах - флотаторах. Они представляют собой цилиндрическую емкость, в которой установлен стакан меньшего диаметра. Кольцевое пространство между стенками корпуса и стака­ на разделено вертикальными перегородками на несколько секций; перегородка между первой и последней секциями сплошная (доходит до дна), а остальные до дна не доходят. В нижней части секций, установлены барботеры, а в верхней части центрального стакана - механический дисковый пеногаситель. Микроб­ ная суспензия подается в первую, самую большую секцию флотатора и после­ довательно проходит через все секции, перетекая под вертикальными перего­ родками. Через барботеры подается воздух, и происходят интенсивное пенооб­ разование и флотация микроорганизмов. Образующаяся пена переливается че­ рез верхний край внутреннего цилиндра и попадает в зону действия устройства механического пеногашения (в необходимых случаях на его диск дополнитель­ но подают воду или химический пеногаситель). Собранная во внутреннем ста­ кане сгущенная суспензия отводится через штуцер и поступает на сепараторы для дальнейшего концентрирования.

Методы разрушения клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) про­ водят физическим, химическим и химико-ферментативным методами.

Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: 1) ультразвуком; 2 ) с помощью вращающихся лопастей или вибраторов - метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; 3) встряхива­ нием со стеклянными бусами; 4) продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; 5) раздавливанием замороженной клеточной массы; 6 ) растиранием в ступке; 7) осмотическим шоком; 8 ) замораживанием - оттаива­ нием; 9) сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением дав­ ления (декомпрессия).