3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

13.4. ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Для получения ферментов используется также и растительное сырье. В

ряде случаев преимущества растений существенны:

•заготовка их технологически более проста;

•высушенный материал можно компактно упаковывать и хранить про­ должительное время в условиях, не требующих специального технологического оборудования.

Для выделения ферментов часто используют семена растений, которые богаты белками, могут сохранять ферментативную активность на протяжении ряда лет. К недостаткам растительного сырья можно отнести сезонность его за­ готовки и неодинаковое содержание ферментов в различных частях растения.

Для производства протеолитических ферментов в промышленных мас­ штабах используют источники сырья, приведенные в таблице 13.2.

Таблица 13.2

Протеолитические ферменты и источники их получения

Отечественная промышленность растительные протеиназы не произво­ дит, так как большинство растений, их продуцирующие, в основном произра­ стают в тропических странах.

В лаборатории ферментных препаратов ГНЦЛС (г. Харьков), впервые по­ лучены ферментные препараты из растительного сырья различной специфики действия: липаза из семян чернушки дамасской (Nigella damascena L); уреаза из столовых арбузов (Citrullus vulgaris L); в-амилаза из проросших семян пшеницы (Triticum aestivum L); в-галактозидаза из семян гороха (Pisum sativum L); инги­

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

битор липазы из семян рапса (Brassica napus L); ингибитор трипсина из семян люцерны (Medicago sativa L); ингибитор амилазы из пшеницы (Triticum aestivum L); в-фруктофуранидаза из семян овса (Avena sativa L) и др.

Для производства ферментов могут быть также использованы продукты пчеловодства. Известно, что пчелиный мед имеет ярко выраженную активность фермента амилазы (диастазы), на разных стадиях разработки и внедрения в производство находятся ферментные препараты из пыльцы растений.

13.4.1. Технология ферментных препаратов из растительного сырья

Технология ферментных препаратов из растительного сырья характеризу­ ется резко выраженным индивидуальным подходом, обусловленного характе­ ром исходного лекарственного растительного сырья, свойствами ферментов и их сопутствующих веществ.

Обычно ферменты в растительном сырье находятся в виде сложных ком­ плексов и для того, чтобы их получить в кристаллическом состоянии и биоло­ гически активными, в первую очередь необходимо подобрать такие методы вы­ деления, чтобы при этом не терялась их специфическая активность.

Общие принципы технологических приемов, включая подготовку сырья и оборудования и заканчивая получением очищенного препарата, не являются унифицированными, а формируются и используются в зависимости от задач технологии, типа и индивидуальных особенностей фермента. Технологическая схема производства аналогична общей технологической схеме производства экстракционных препаратов и состоит в основном из следующих стадий:

•экстракция лекарственного растительного сырья;

•выделение и очистка фермента;

•сушка;

•стандартизация;

•получение лекарственной формы.

Перед экстракцией фермента исходное сырье подвергают измельчению с целью разрушения клеток. Для этого применяют промышленные мельницы (вальцы, дезинтеграторы, дисмембраторы).

В качестве экстрагента ферментов используют воду, водные растворы ор­ ганических растворителей (спиртов, ацетона, эфира, диоксана), разбавленные

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

растворы кислот и щелочей, растворы нейтральных солей, а также буферные растворы. Экстрагент подбирается индивидуально для каждого ферментсодер­ жащего растительного сырья. Гидролитические ферменты, например, амилазы и протеиназы, наиболее полно экстрагируются из растительного сырья с по­ мощью воды.

Экстракт, полученный в результате избирательной экстракции, наряду с ферментами содержит сопутствующие белки, липиды, пигменты, неорганиче­ ские ионы, полисахариды, а также другие вещества неферментной природы. Удаление сопутствующих компонентов и достижение высокой степени очистки ферментного белка требует сочетания различных методов выделения. На пер­ вой стадии очистки экстракта может быть использована кислотная денатурация, позволяющая за счет смещения величины рН среды перевести нерастворимое состояние белки. Иногда, с осторожностью, проводят их температурную дена­ турацию путем кратковременного прогрева экстракта при температурах, не вы­ зывающих денатурацию выделяемого фермента. Указанные методы могут соче­ таться. Применяют также осаждение неактивных примесей солями тяжелых ме­ таллов. С целью очистки экстракта от компонентов, отличающихся размерами молекул, применяют диализ через мембраны с определенной величиной пор (целлофан, коллодий, пергамент). Используют также стандартные мембраны из целлюлозы и ее производных. Электродиализом пользуются редко из-за опас­ ности местного нагрева и возможности нежелательного сдвига рН.

После предварительной очистки, а иногда и без нее, экстракт подвергают фракционированию органическими растворителями, нейтральными солями, сорбции-десорбции на разнообразных адсорбирующих материалах, очистке с помощью ионообменных смол, гель-фильтрации и т.д.

Фракционная очистка. Для фракционной очистки с применением орга­ нических растворителей используют спирты (этанол, метанол, изопропанол, ацетон, реже диоксан, диэтилкарбинол, ароматические и гетероциклические амины). Для уменьшения денатурирующего воздействия осаждение ведут при пониженных температурах.

При фракционировании ферментов под действием солей часто использу­ ют сульфат аммония, реже применяют сульфаты и ацетаты натрия и магния. В отличие от органических растворителей, которые сравнительно легко удаляют­

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

ся центрифугированием, солевые осадители из полученного материала можно удалить диализом, занимающим продолжительное время.

Ферменты обладают способностью адсорбироваться на активированном угле, крахмале и его производных, гидроокиси цинка, магния, алюминия, меди, на бетонитах, каолине, геле трифосфата кальция, целлюлозе и ее производных и других материалах.

Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография является бо­ лее тонким и избирательным методом очистки ферментов, в основе которой лежит реакция обмена между ионитами и белками, находящимися в растворе. Разделение при этом основано на различиях в суммарных зарядах присутствующих веществ при данном значении рН (вещества, имеющие большой заряд удерживаются силь­ нее и элюируются позже). В качестве ионитов используют катиониты, содержащие кислые радикалы: карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ); фосфоцеллюлозу (ФЦ); сульфометилцеллюлозу (СМЦ); сульфоэтилцеллюлозу (СЭЦ).

Применение находят также иониты, имеющие в своем составе основную группу: аминоэтилцеллюлоза (АЭЦ); диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); этилцеллюлоза (ЭЦ); триэтиламиноцеллюлоза (ТЭАЦ); гуанидиноэтилцеллюло­ за (ГЭЦ).

Разделение и концентрирование. Для разделения и концентрирования ферментных белков часто используют метод гель-фильтрации с применением сефадеков - полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенных через определенные промежутки поперечными связями и образующих своеобразные молекулярные сита, способные разделять белки в соответствии с их молекуляр­ ной массой. При гель-фильтрации или эксклюзионной хроматографии время выхода вещества из хроматографической колонки зависит от размера его моле­ кул или молекулярной массы (более крупные молекулы не входят в поры сор­ бента и элюируются раньше).

Для концентрирования ферментного белка часто используют ультра­ фильтрацию. Метод заключается в разделении высокомолекулярных и низко­ молекулярных соединений на селективных мембранах, способных пропускать низкомолекулярные соединения под действием давления. Ультрафильтрация в 5-10 раз эффективнее очистки с использованием фракционирования этанолом.

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

Кристаллизация ферментов. Кристаллизация ферментов является слож­ ным методом их очистки и применяется для субстанций прошедших концен­ трирование и многоступенчатую очистку.

Кристаллическое состояние не является критерием гомогенности фер­ ментного белка, а требует дополнительного подтверждения другими методами (диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, ультрацентрифугированием и др.). Методы и техника кристаллизации подбираются индивидуально для каж­ дого фермента.

13.4.2. Частная технология ферментных препаратов

растительного происхождения

Уреазу (Ureasum) получают из семян столового арбуза (Citrullus vulgaris L.). Технология препарата разработана С.И. Дехтяревым (ГНЦЛС).

Предварительно измельченные семена столового арбуза с помощью вал­ ковой дробилки экстрагируют в реакторе при периодическом перемешивании смесью раствора солей натрия хлорида и натрия карбоната (рН 7,9-8,1) в тече­ ние двух часов при температуре 22±2°С. По истечении указанного времени со­ держимое реактора переносят на конус вращающегося барабана центрифуги. В качестве фильтрующего материала используют бязь, которой покрывают бара­ бан в два слоя. Частота вращения ротора центрифуги 3000 об/мин. Мутный экс­ тракт из приемника центрифуги переносят порциями в стаканы центрифуги. Повторное центрифугирование проводят в течение 30 минут. Экстракт аккурат­ но сливают в емкость и помещают в холодильный шкаф для охлаждения до +10°С.

Выделение уреазы из экстракта осуществляют в реакторе путем обработ­ ки его насыщенным раствором аммония сульфата в буферном растворе (рН 7,0) при периодическом перемешивании. Образовавшуюся суспензию осадка белка отстаивают в течение 6 часов. По истечении указанного времени суспензию из реактора переносят порциями в стаканы центрифуги и центрифугируют в тече­ ние 20 минут. Осадок сопутствующего белка отбрасывают, а надосадочную жидкость вновь подают в реактор.

Проводят второе высаливание, добавляя в реактор насыщенный раствор аммония сульфата. Суспензию в реакторе оставляют на 12 часов. По истечении

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

этого времени осадок белка, состоящий из активного фермента, отделяют цен­ трифугированием в течение 30 минут при частоте вращения ротора 3000 об/мин. Полученный осадок растворяют в очищенной воде и охлаждают в холо­ дильном шкафу до температуры +10°С.

Затем проводят фракционное осаждение фермента этанолом, добавляя его в раствор в соотношении 1:2. Образовавшуюся суспензию фермента переносят порциями в стаканы центрифуги и центрифугируют в течение 15 минут. Осадок активного фермента в виде мазеобразной массы остается на дне стаканов. Оса­ док растворяют в очищенной воде и сушат методом сублимации с оптимальным режимом температур (-40) °С;+30°С. Длительность замораживаниявысушивания 2-3 часа, досушивания - 8-10 часов. После окончания сушки по­ рошок фасуют в склянки оранжевого стекла объемом 0,2 л. Выход препарата 0,3%. Активность не менее 1500 ЕД Самнера в 1 г препарата или 100-200 ФЕ в 1 мг белка.

Уреаза катализирует реакцию гидролиза мочевины на углекислый газ и аммиак. Применяют микрокапсулированную уреазу для очистки крови от моче­ вины и для проведения гемодиализа в аппарате «искусственная почка».

В таблице 13.3 приведены препараты ферментов растительного происхо­ ждения, выпускаемые предприятиями медицинской и микробиологической промышленности стран СНГ и ближнего зарубежья.

Таблица 13.3 Лекарственные ферментные препараты из растительного сырья

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

13.5. ПРОИЗВОДСТВО ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ

МЕТОДОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА.

Получение ферментов на основе методов микробиологического синтеза является перспективным. Основное направление микробиологического синтеза - использование клеток микроорганизмов для производства ферментов, анти­ биотиков, витаминов, алкалоидов, аминокислот, органических кислот, полиса­ харидов и т.п. Биосинтетические методы отличаются высокой производитель­ ностью за счет способности микроорганизмов интенсивно и быстро размно­ жаться. Методы биотехнологического производства ферментов являются эко­ номически более эффективными, чем получение БАВ из достаточно дорогого и дефицитного животного сырья.

Промышленное биопроизводство ферментных препаратов осуществляют из культур микроорганизмов: плесневых грибов, бактерий, дрожжей, акктиномицетов. В последние годы для серийного производства ферментов используют в основном мицелляльные грибы родов Aspersillus, Penicillinum и Rhizopus, а также организмы-продуценты бактерий рода Bacillus, Escherihia coli и другие.

Они способны продуцировать большое число разнообразных по своему составу ферментов, что обусловлено специфическими способностями их фер­ ментативного аппарата, высокой способностью к размножению и адаптации в различных условиях окружающей среды. Используя культуры микроорганиз­ мов, можно гораздо быстрее получить большое количество биологического ма­ териала (биомассы) для последующего выделения ферментов. Для питания микробных клеток могут быть использованы разнообразные продукты и отходы пищевой промышленности (пшеничные и рисовые отруби, картофельная мезга, пшеничная шелуха, подсолнечная лузга, меласса, кукурузная мука и т.п.). Сы­ рье для микробиологического синтеза более подробно описано в главе 14.

Биотехнологический процесс включает большой объем подготовительной работы, предшествующий выделению ферментов: очистку и стерилизацию воз­

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТОВ

Для приготовления питательных сред использую сырье минеральное, жи­ вотного и растительного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Вещества, входящие в состав питательной среды, обеспечивающие раз­ витие культуры и биосинтез определяемых продуктов, не должны содержать вредных примесей. При выборе сырья необходимо учитывать его себестои­ мость, так как в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов. Помимо основных компонентов питательных сред, в процессе ферментации нередко используют дополнительные виды сырья - предшественники (синтетические продукты, входящие в состав молекулы це­ левого продукта и добавляемые в ферментационную среду для интенсификации процесса биосинтеза), ПАВ (главным образом для пеногашения), антибактери­ альные препараты и другие.

13.5.1. Культивирование микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов осуществляют в основном глубинным способом в жидкой питательной среде при строго определенном значением рН, времени и температуры, подавая стерильный воздух. Очистку подаваемого воз­ духа проводят путем многоступенчатой фильтрации. Задерживающая способ­ ность воздушных фильтров должна быть не ниже 99,99%.

Для культивирования в микробиологических производствах применяют разнообразные ферментаторы, которые условно подразделяют на: барботажные, эрлифтные, барботажно-эрлифтные, с механическим перемешиванием, барботажные с циркуляционным перемешиванием, с эжекционной системой и др. По структуре потоков ферментаторы могут быть аппаратами полного перемешива­ ния или полного вытеснения. По способу ввода энергии и аэрации различают аппараты с вводом энергии в газовую фазу, в жидкую фазу или комбинирован­ ные.

Объем производственных ферментаторов может быть от 10 до 1000 м3 с механическим перемешиванием и барботажем. Ферментаторы обычно пред­ ставляют собой герметические цилиндрические емкости, высота которых в 2­ 2,5 раза превышает диаметр, чаще всего изготовленные из нержавеющей стали. В ферментаторах устанавливают мешалки турбинного, пропеллерного и другого типов, диаметр которой составляет примерно 1/3 диаметра аппарата. В произ­