3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ГЛАВА 14. ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

14.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнология - это наука об использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве. Европейская федерация биотехноло­ гии ^FB ) определяет современную биотехнологию как использование наук о природе (биологии, химии, физики) и инженерных наук (например, электрони­ ки) применительно к биосистемам в биоиндустрии.

Биотехнология формировалась и эволюционировала по мере формирова­ ния и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и раз­ витие условно можно подразделить на четыре периода: эмпирический, этиоло­ гический, биотехнический и геотехнический.

Эмпирический (от греч. empeirikos - опытный) или доисторический пе­ риод - самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет - до нашей эры и около 2000 лет - нашей эры.

Человек с древних времен начал использовать деятельность микроорга­ низмов, не подозревая об их существовании, и эмпирически совершенствовал технологию применения этих организмов во многих отраслях хозяйства. Труд­ но точно установить, где и в каких отраслях хозяйства впервые начали исполь­ зовать жизнедеятельность микроорганизмов. По-видимому, это определялось многими факторами и шло иногда параллельными путями у разных народов.

Еще в древние времена процессы брожения использовались при приго­ товлении теста. Египтяне для приготовления хлеба использовали осадки бро­ дящего пивного сусла. В пирамидах Египта сохранились рисунки, изображаю­ щие технологию приготовления вина. Около двух тысяч лет назад начало раз­ виваться виноделие во Франции, а затем и в других странах Европейского кон­ тинента. На территории СНГ (в Грузии, Армении, на побережье Азовского мо­ ря) вина стали изготавливать с давних времен. Хлебные напитки, напоминав­ шие современное пиво, также имеют многовековую историю. Предполагают, что пиво изготавливали за 7000 лет до н.э.

Этиологический (от греч. аШа - причина) период в развитии биотехно­ логии охватывает вторую половину 1ХХ века и первую треть ХХ века (1856­ 1933). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского уче­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ного Луи Пастера - основоположника научной микробиологии. Пастер неоспо­ римо доказал, что процессы брожения - не простые химические явления, а ре­ зультат действия на субстраты определенных микроорганизмов. Это показано им при исследовании молочнокислого, спиртового, маслянокислого брожений. Пастер первый установил также, что не все микроорганизмы нуждаются в мо­ лекулярном кислороде. Изучая маслянокислые бактерии, он показал, что воздух вреден для них. Так были открыты облигатные анаэробы. Велики заслуги Пас­ тера и в познании причин инфекционных заболеваний человека и домашних животных, а также в разработке способов борьбы с ними. Луи Пастер по праву считается основоположником современной микробиологии, в том числе про­ мышленной.

В развитие отечественной и мировой микробиологии большой вклад внес С.Н. Виноградский (1856-1953). Наряду с фундаментальными работами по микробиологии почвы он совместно с В.Л. Фрибесом выделил и изучил ана­ эробную бактерию, разлагающую пектиновые вещества и вызывающую раз­ рыхление льняных волокон при промышленном процессе - мочке лубяных культур. Эти работы имели не только теоретическое, но и большое практиче­ ское значение. Ученику Виноградского В.Л. Омелянскому (1867-1928) принад­ лежат классические исследования по анаэробному разложению целлюлозы и образованию микроорганизмами метана.

Биотехнический период начался с внедрения в биотехнологию крупно­ масштабного герметизированного оборудования, обеспечившего ведение про­ цессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промыш­ ленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939-1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами). С конца XIX века в ряде стран появились сообщения о возможности получения органических кислот с помо­ щью микроорганизмов, делались попытки наладить их производство. В 1923 г. организовано первое микробиологическое промышленное производство лимон­ ной кислоты, затем были созданы производства молочной, глюконовой и неко­ торых других органических кислот. На этом этапе они оказались более рента­ бельными и вытеснили другие химические процессы. Вплоть до 1940 г. произ­ водство ряда органических кислот, ацетона, бутанола, пропанола, этилового спирта, глицерина осуществлялось в основном микробиологическими способа­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ми. Впоследствии методы органического синтеза и очистки настолько усовер­ шенствовались, что некоторые из этих веществ начали производить химическим способом. В 1948 г. было показано, что с помощью микроорганизмов можно по­ лучать витамин В1 2 , который ни растения, ни животные не синтезируют.

Геннотехнический период (от греч. genesis - происхождение, возникно­ вение, рождение) начался с 1972 г., когда П.Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфических ферментов привело к формированию строго научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генно-инженерных работ.

Для геннотехнического периода характерны: разработка интенсивных процессов (вместо экстенсивных) на основе направленных фундаментальных исследований (с продуцентами антибиотиков, ферментов, аминокислот, вита­ минов), создание суперпродуцентов, получение необычных организмов, ранее не существовавших в природе, разработка и внедрение экологически чистых и безотходных технологий.

Объекты биотехнологии многочисленны. Это представители основных групп живых организмов - микроорганизмы (бактерии, вирусы, дрожжи, одно­ клеточные организмы), растения, животные а также изолированные из них клетки и субклеточные компоненты. Биотехнология базируется на протекаю­ щих в этих живых системах физико-химических, биохимических, физиологиче­ ских процессах, в результате которых происходят выделение энергии, синтез и деградация продуктов, формирование организованных структур.

На начальном этапе своего развития биотехнология в основном пользова­ лась живыми системами в том виде, в каком они существовали в природе. Сле­ дующий шаг - использование традиционных методов селекции (искусственно­ го отбора) микроорганизмов, растений и животных, получение более продук­ тивных штаммов, линий. В последние годы целенаправленное улучшение свойств живых систем, как объектов биотехнологии, резко ускорилось и рас­ ширилось, после того, как с середины 80-х годов были разработаны методы генной инженерии. В 1980-1982 гг. появились методы переноса генов в целые (многоклеточные) животные организмы и почти одновременно - методы пере­ носа генов в растительные клетки и в целые растения. Микроорганизмы, а так­ же клетки, растущие вне организма, после переноса в них новых генов называ­ ют генетически трансформированными клетками. Трансформированными

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

можно называть и многоклеточные организмы - но чаще их обозначают как трансгенные животные и растения. Генетический материал переносят в клетки и организмы с помощью разных методов. В микроорганизмы гены вводят в со­ ставе кольцевых молекул - плазмид, добавляя их в среду при культивировании. В клетки животных гены вводят либо, добавляя их в среду культивирования, либо впрыскивая (микроинъекция) с помощью шприца или микропипетки.

Особые приемы используют для переноса генов в целые животные орга­ низмы. Один из них заключается в том, что очищенные гены впрыскивают в только что оплодотворившиеся яйцеклетки (зиготы) с помощью шприца и мик­ ропипетки, кончик которой вводят непосредственно в ядро. Существует подход переноса генов в растения, который состоит в том, что гены вводят в изолиро­ ванные клетки, лишенные полисахаридных стенок (такие клетки называют про­ топластами), затем из этих клеток получают целые растения.

14.2.СОВРЕМЕННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ

Внастоящее время существует несколько направлений биотехнологиче­ ских производств:

1.Производство препаратов на основе микробиологического синтеза (ви­ тамины, антибиотики, ферменты).

2.Культивирование клеток и тканей животных и человека (интерферон, инсулин, моноклональные антитела, гормоны роста, вирусные вакцины).

3.Культивирование клеток и тканей растений (алкалоиды, оксикоричные кислоты, полисахариды).

4.Инженерная энзимология (ферментная технология).

14.2.1. Микробиологический синтез

Микробиологический синтез - получение полезных для человека веществ на основе культивирования микроорганизмов. В процессе своего роста некото­ рые микроорганизмы способны накапливать в культуральной среде или внутри клетки различные классы соединений.

На основе микробиологического синтеза в настоящее время получают следующие классы соединений: алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, анти­ оксиданты, белки, витамины, гербициды, ингибиторы ферментов, инсектициды, ионофоры, коферменты, липиды, нуклеиновые кислоты, органические кислоты,

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

пигменты, поверхностно-активные вещества, полисахариды, противоопухоле­ вые агенты, растворители, ростовые гормоны растений, сахара, стерины и сте­ роиды, факторы транспорта железа, ферменты, эмульгаторы.

Технология микробиологического синтеза строится на знании свойств микроорганизма-продуцента. Только при создании оптимальных для данного вида микроорганизмов условий можно получить максимальный выход того продукта, который он может синтезировать.

Для выращивания микроорганизмов-продуцентов применяют два способа культивирования — поверхностный и глубинный.

Технология выращивания микроорганизмов поверхностным способом за­ ключается в том, что микроорганизмы культивируют на поверхности твердых или жидких питательных сред. В качестве твердых питательных сред исполь­ зуют агаризованные среды или сыпучие субстраты (пшено, ячмень, пшеничные отруби и т. п.). Агаризованные питательные среды стерильно разливают по пробиркам, чашкам Петри, стеклянным флаконам или в матрацы. После засева культуры-продуцента на стерильную питательную среду пробирки или чашки Петри помещают в термостат, где при определенной температуре происходит рост и развитие микроорганизмов. Сыпучие субстраты равномерно распреде­ ляют слоем в специальные кюветы, которые после засева посевного материала помещают в растильные камеры. Выращивание микроорганизмов при опти­ мальных условиях продолжается в течение несколько дней. После завершения процесса выращивания микроорганизмов выделяют конечный продукт. Про­ цесс выращивания микроорганизмов поверхностным способом заканчивается за определенный период времени и поэтому является периодическим.

Выращивание микроорганизмов глубинным способом происходит во всем объеме жидкой питательной среды - в специальном аппарате - ферментаторе. Выращивание микроорганизмов глубинным способом может быть периодиче­ ским, полупериодическим и непрерывным (проточным).

Периодический процесс происходит при единовременной загрузке всех компонентов питательной среды и посевного материала в аппарат в начале про­ цесса. Через определенное время аппарат полностью разгружают. Для таких про­ цессов характерно непрерывное изменение физиологического состояния клеток и состава культуральной среды, связанное с жизнедеятельностью микроорганизмов.

Полупериодический процесс отличается от строго периодического тем, что в нем вещества, необходимые для роста и развития микроорганизмов, до­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

бавляют в аппарат по ходу культивирования. Аппарат, как и в предыдущем случае, разгружают единовременно. Добавление питательных веществ или дру­ гих компонентов в ходе ферментации позволяет создать благоприятные усло­ вия для жизнедеятельности культуры в различных фазах культивирования. Следует отметить, что в аэробных микробиологических процессах один из суб­ стратов - атмосферный кислород - поступает непрерывно. Так что чисто пе­ риодическим является только анаэробный процесс.

Непрерывный процесс характеризуется тем, что подача питательной сре­ ды в аппарат и отбор культуральной жидкости из него происходят непрерывно. При постоянной скорости протока в таких системах устанавливается стацио­ нарное состояние, которое может сохраняться в течение длительного времени. Концентрация биомассы, субстратов, удельная скорость роста микроорганиз­ мов и другие параметры при этом постоянны.

Понятно, что условия для роста микроорганизмов при периодическом и непрерывном процессе резко различны. При периодическом процессе концен­ трация питательных веществ с течением времени в среде уменьшается, а со­ держание продуктов метаболизма увеличивается, что неблагоприятно влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. При непрерывном процессе эти два по­ казателя поддерживают на постоянном уровне, что создает наиболее благопри­ ятные условия для роста микроорганизмов.

Технологический процесс микробиологического производства представ­ ляет собой совокупность взаимосвязанных технологическими потоками опера­ ций, обеспечивающих переработку исходных материалов в готовый продукт. Основные стадии микробиологического синтеза представлены на рисунке 14.1.

Стадия получения посевного материала. Посевным материалом назы­ вают чистую культуру микроорганизма-продуцента, размноженную до такого количества (объема), которое необходимо для засева промышленных аппаратов.

На практике применяют в основном штаммы четырех видов микроорга­ низмов: дрожжей, мицелиальных грибов, собственно бактерий, актиномицетов. Используют также культуры клеток млекопитающих, растений и гибридов.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Рис. 14.1. Основные стадии микробиологического синтеза

Кштаммам - продуцентам предъявляются следующие требования:

1.Безвредность для потребителя, производственного персонала, окру­ жающей среды;

2.Возможность роста на дешевых субстратах;

3.Высокая скорость роста и короткий срок накопления искомого вещества;

4.Сверхсинтетическая способность желаемого продукта и низкая - по­ бочных продуктов;

5.Стабильность в продуктивности и к требованиям условий культивиро­

вания;

6.Устойчивость к фаговой и другой инфекциям;

7.Желательны штаммы термофилов и ацидофилов (алкалофилов), так как с ними легче поддерживать стерильность производства;

8.Представляют интерес анаэробные штаммы, так как аэробы создают трудности инженерного плана - требуют аэрирования;

9.Образуемый продукт должен легко выделяться.

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Для получения посевного материала используют исходную культуру про­ дуцента, хранящуюся в центральной заводской лаборатории.

Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны ее название (род, вид), коллекционный номер, серия и дата выпуска, средний уро­ вень активности, срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Чтобы свойства культуры-продуцента оставались без изменения, ее надо хранить в соответствующих условиях.

Наиболее распространены следующие способы хранения культур:

Хранение в холодильнике. Это самый простой способ, заключающийся в том, что готовую культуру на агаризованной среде в пробирках помещают в холодильник и хранят при температуре 4 °С в течение 1-2 мес.

Хранение под слоем минерального масла. На твердых средах под слоем стерильного вазелинового масла или парафина можно хранить культуру не­ сколько месяцев. Толщина слоя масла должна быть не менее 1 см. При большей толщине масла может произойти гибель аэробной культуры из-за недостатка кислорода.

Хранение в сыпучих материалах. Суспензию микроорганизмов или спор наносят на предварительно простерилизованный сыпучий материал (почву, пе­ сок, глину, зерно) высушивают при комнатной температуре и хранят в стеклян­ ной посуде, закрытой ватной пробкой.

Замораживание и хранение при температуре ниже -20 °С. Сублимационная сушка. В настоящее время сублимационная сушка явля­

ется наиболее перспективным способом длительного хранения микроорганиз­ мов. Вначале в культуру микроорганизмов добавляют так называемую защит­ ную среду (сахарозу, бульон), которая предохраняет клетки от инактивации за счет снижения лиофильного взаимодействия воды с клетками, разливают в сте­ рильные ампулы и закрывают стерильными ватными тампонами. Затем прово­ дят быстрое замораживание при температуре -35 -78 °С. Ампулы с заморожен­ ной культурой переносят в вакуум-сушильный аппарат и подвергают сублима­ ционной (из твердой фазы в газообразную) сушке при комнатной температуре и остаточном давлении 1-10 кПа в течение 25-30 ч. Срок хранения 5-6 лет.

Технология получения посевного материала в цехе чистой культуры.

Приготовление посевного материала в зависимости от вида продуцента, его фи­ зиолого-биохимических особенностей состоит из нескольких этапов. Исходную

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

культуру размножают в пробирке в стерильных условиях, при оптимальном со­ ставе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длитель­ ность). Выращенную культуру стерильно переносят в колбы с жидкой пита­ тельной средой. Перемешивание увеличивает скорость роста культуры, благо­ даря интенсификации массообмена. На второй стадии выращивания посевного материала готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор). Количество посевного материала в инокуляторе должно состав­ лять 10-12% от объема питательной среды. Третья стадия культивирования осуществляется в посевном аппарате большего объема. Для этого все содержи­ мое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема. Получен­ ный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и био­ химическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальней­ ший производственный цикл.

Стадия приготовления питательных сред. Для накопления, выделения, сохранения микроорганизмов, а также для получения биологически активных ве­ ществ пользуются питательными средами, которые не только содержат необходи­ мые питательные вещества, но и являются средой обитания микроорганизмов.

Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов (источники азота, углерода, фосфора, микроэлементов, витаминов и др.), но также и физико-химические и физические факторы (активная кислотность, окислитель­ но-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы, взятые вместе и каждый в отдельности, играют существенную роль при развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимиче­ ских функций. Обычно изменение одного из факторов среды влечет за собой из­ менение другого.

По физическому состоянию среды можно разделить на три группы: твер­ дые (приготовленные на агар-агаре, желатине или кремниевых пластинах), жидкие и сыпучие (увлажненные отруби, зерно). По составу среды делятся на две основные группы: натуральные и синтетические.

Натуральными называют среды неопределенного химического состава, которые включают продукты животного или растительного происхождения. Ос­ новой для натуральных сред являются различные части зеленых растений, жи­ вотные ткани, солод, дрожжи, овощи, фрукты. Подавляющее большинство их используется в виде экстрактов и настоев. На натуральных средах хорошо разви­

ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

ваются продуценты, но они не пригодны для изучения физиологии обмена ве­ ществ. На таких средах невозможно учесть потребление отдельных компонентов среды, а также идентифицировать продукты метаболизма из-за сложности и не­ определенности их состава. Натуральные среды непостоянны по составу, так как существенно зависят от сырья и условий приготовления. Их используют для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагности­ ческих целей. Натуральные среды нашли широкое применение в микробиологи­ ческой промышленности. В состав производственных сред входят вещества, бо­ гатые углеводами (кукурузная мука, гидрол, патока, пшеничная мука) и азотом (белковые продукты - соевая мука, жмыхи, кукурузный экстракт).

Синтетические среды - это такие, в состав которых входят определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. При­ готовлять синтетические среды следует только на дистиллированной воде. Синтетические среды могут быть довольно простыми и состоять из небольшого числа веществ, а могут быть составлены из большого числа различных компо­ нентов, т. е. быть комплексными средами. Только синтетические среды исполь­ зуются для изучения физиологии и обмена веществ микроорганизмов.

В качестве сырья для приготовления питательных сред используют специально подготовленную воду, которая должна быть биологически чистой, бесцветной, без привкуса и запаха, не должна давать осадка. Сухой остаток во­ ды не должен превышать 1000 мг/л, общая жесткость не должна быть больше 7 мг-экв/л. Слишком жесткая вода замедляет рост микроорганизмов. Содержание вредных примесей в воде не должно превышать следующих значений, мг/л: свинец - 0,1; цинк - 5,0; мышьяк - 0,05; медь - 3,0; фтор - 1,5. Общее число микроорганизмов в 1 мл воды не должно быть более 100.

Источники углерода. Они используются микроорганизмами для синтеза клеточных структур и одновременно служат источником энергии. Самым дос­ тупным для микроорганизмов источником углерода из углеводов является глю­ коза, однако из-за высокой стоимости ее используют лишь для биосинтеза до­ рогостоящих метаболитов. Для крупнотоннажных микробиологических произ­ водств используют другие, более дешевые углеводсодержащие продукты - раз­ личные отходы сельского хозяйства, целлюлозно-бумажной и пищевой про­ мышленности: мелассу, гидрол, крахмал картофельный, кукурузную муку, пшеничные отруби, гидролизаты полисахаридов, молочную сыворотку, солодо­ вое сусло.