4 курс / Акушерство и гинекология / Гришин_И_И_Эмболизация_маточных_артерий_Новые_технологии_в_оперативной

1)– нормальный шеечный (многослойный плоский эпителий + парабазальные клетки)

2)– кроме нормального клеточного эпителия встречаются лейкоциты в умеренном количестве

3)– наряду с клетками многослойного плоского эпителия встречаются клетки зрелой и незрелой плоскоклеточной метаплазии

4)– комплексы клеток с дискариозом различной степени выраженности

5)– кроме клеток нормального строения встречаются атипические клетки.

Аспирационная биопсия эндометрия

Аспирационную биопсию эндометрия использовали как скрининговый метод анализа состояния эндометрия не только при его изменении по данным УЗИ, а также до проведения оперативных вмешательств, но и при динамическом наблюдении. Методика аспирационной биопсии: с помощью специального катетера «Пайпель», после определения размера и положения матки, вводят катетер в полость матки и производят аспирацию её содержимого. Полученный материал наносят на предметное стекло, приготавливают тонкий мазок (как при исследовании крови). Чувствительность метода составляет 62,5–91,5%, специфичность — 94%, ложноположительные результаты встречаются в 31% случаев, ложноотрицательные — 7,9%. Исследование эндометрия проводилось в лаборатории ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова

Патоморфологическое исследование эндометрия.

Гистероскопия и РДВ цервикального канала и полости матки. Гистероскопическое исследование проводилось на аппаратах «K.STORZ, R.WOLF» (Германия); Патоморфологическое исследование соскоба из полости матки. Проведено в патологоанатомическом отделении Московской городской клинической больницы №1 им. Н.И. Пирогова (заведующий отделением д.м.н., профессор А.П. Ракша). Путем вакуум – аспирации или

51

кюретажа получали соскоб из полости матки, при осмотре оценивались объем присланного материала, размеры и его форма, материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение суток. Заливая в парафин, используя ускоренный способ заливки по Меркулову. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином.

Первоначально микроскопическое исследование проводилось на малом увеличении микроскопа (окуляр-х7, объектив-х8). При этом изучение ткани эндометрия выполнялось по определенной схеме, с выявления толщины функционального слоя, наличия его деления соответствия определенной фазе менструального цикла. Уточнение и детальное изучение препаратов проводилось при большем увеличении микроскопа (окуляр-х10, объективх40). Заключение о состоянии эндометрия делалось после исследования всех перечисленных параметров.

Артериография и эмболизация маточных артерий.

Артериография органов малого таза непосредственно перед эмболизацией маточных артерий. Все эндоваскулярные и хирургические исследования и вмешательства проводились на современных ангиокардиографических аппаратах PHILIPS INTEGRIS ALLURA 9000 (PHILIPS, Голландия) и OEC-9800 (GENERAL ELECTRIC, США), с

функцией цифровой субтракционной ангиографией с возможностью смещения субтракционной маски, пульсовой рентгеноскопией до 25 кадров в секунду. Для инъекции контрастного вещества применялись автоматические шприцы-инъекторы Angiomat 6000 (LIEBEL-FLARSHEIM, США) и

MEDRAD PPD (Medrad, США), оснащенных функцией синхронизации с ангиографическим аппаратом. В ходе эндоваскулярного вмешательства проводилось мониторирование состояния пациентов при помощи кардиомониторов MARQUTTE DASH 2000 (GENERAL ELECTRIC, США).

Эндоваскулярные диагностические и лечебные вмешательства выполнялись

52

сотрудниками отделения Федерального Центра рентгенохирургических методов диагностики и лечения ГКБ№1 им. Н.И. Пирогова и сотрудниками ПНИЛ внутрисердечных и контрастных методов рентгенологических исследований ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (руководитель – д.м.н., профессор С.А. Капранов).

Определение онкомаркеров.

Определение онкомаркеров крови (СА-125) проводилось электролюминесцентным методом на микрочастицах, на аппарате ELECSUS 2010 фирмы ROCHE HITACHI (Япония);

Иммуногистохимические исследования содержания и локализации в эндометрии белков плотных контактов эпителиальных клеток CLDN-3 и CLDN-5, фактора пролиферации Кi-67, апоптозного фактора APAF-1.

Данные исследования проводились на базе первого патологоанатомического отделения ФГУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (директор центра – академик РАМН д.м.н., профессор Г.Т. Сухих) .

Из парафиновых блоков образцов эндометрия выполняли срезы толщиной 4-5 мкм. Блокирование эндогенной пероксидазы проводилось 3% раствором перекиси водорода в депарафиновых срезах. Демаскировку антигенов осуществляли в СВЧ печи в течение 20 минут в цитратном буфере с рН=6,0. В качестве первичных специфических антител использовались моноклональные антитела к CLDN-3 (LabVision, ready-to-use), CLDN-5 (LabVision, ready-to-use), антитела к Ki-67 (LabVision, 1:100), к белку APAF-1 (LabVision, 1:100). Для метки вторичных антител использовался авидинбиотиновый комплекс (UltraVHRPpolymerKIT, LabVision). Для визуализации места связывания антигена с антителом использовалась метка – фермент пероксидаза хрена в присутствии субстрата пероксида водорода и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином

53

(DABsubstrate+chromogen, LabVision). В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде светло-коричневого окрашивания структур клеток. Для облегчения визуализации локализации антигенов в тканях проводили окраску ядер гематоксилином. Ставился отрицательный контроль реакции на срезах без специфических первичных антител и положительный контроль на срезах эндометрия стадии пролиферации.

Результаты иммуногистохимической реакции для Ki-67, CLDN-3, CLDN-5, APAF-1 оценивались полуколичественным методом по количеству позитивно окрашенных клеток, а также оценивалась локализация продукта реакции – мембранное и цитоплазматическое окрашивание, а также его интенсивность [49, 66, 194].

Оценка интенсивности реакции проводилась по 6-ти бальной системе: 0 баллов – отсутствие или менее 5% окрашенных клеток, 1 балл – 5-10%, 2 балла – 10-20%, 4 балла – 20%-40%, 6 баллов – более 40% положительных клеток.

Молекулярно-биологические исследования, биомолекуллярного маркера неоангиогенеза VEGF, рецептов к прогестерону и эстрадиолу.

Данные исследования проведены на базе лаборатории клинической иммунологии ФГУ «НЦАГ и П им. академика В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Ткань эндометрия, полученную путем кюретажа или пайпель-биопсии, помещали в пробирку типа «эппиндорф» с раствором RNA-later (QIAGEN) и хранили при температуре –20°С. Исследование всех полученных образцов выполнялись одновременно. Из образцов ткани выделялась тотальная РНК с помощью набора RNeasyMiniKit (QIAGEN), включавшего в себя абсорбционные колонки, RLT-буфер, RW1-буфер, RPE-буфер. Качество полученной РНК на наличие 28S и 18S субъединиц рибосомальной РНК проверяли при электрофорезе в 1% агарозном геле. Затем проводилось

54

построение цепи комплементарной ДНК (кДНК) при помощи обратной транскрипции с использованием oligo (dT)18 нуклеотидов и M-MLV- обратной транскриптазы в составе набора для обратной транскрипции

FirstStrandcDNASynthesisKit (Fermentas, Россия).

Для изучения экспрессии выбранных генов использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Real-time PCR, RT-PCR), выполненной на амплификаторе «RotorGene 6000» (фирма «Corbett Research») с использованием интеркалирующего красителя SYBR-greenI (ЗАО «Синтол», Россия).

Количественную оценку проводили с использованием метода относительного количественного анализа (∆∆Сt) (рис. 2.1).

Для этого для каждого исследуемого гена (А) высчитывалась разность в циклах (∆Ct) между исследуемым геном (A) и геном «домашнего хозяйства» (house-keepinggene) b2 микроглобулином (HS-gene) при выходе кривой амплификации в стадию экспоненциального роста. Пороговый уровень (Threshold) устанавливался вручную, согласно рекомендациям к прибору и данным литературы.

DСt-относительная концентрация кДНК

DСt (А)=Сt(A)-Ct(HS-gene) DСt (А) патология

DDСt =

DСt (А) норма

Рис. 2.1 Анализ кривых амплификации методом (∆Ct)

55

Далее высчитывался уровень экспрессии каждого гена, выраженный в числе копий. Для этого эффективность реакции принималась равная 2. Тогда в соответствии со значениями ∆C высчитывалось число копий равное 2-∆Ct . Затем статистически обсчитывалась разница значений уровня экспрессии между исследуемой и контрольной группами (2-∆∆Ct).

В работе были использованы следующие праймеры: VEGF - 5'-

CAATCCAAATGCGGCATCT -3' (антисенс-праймер).

Для каждого образца кДНК одновременно ставилась ПЦР-реакция в 2- х пробирках: с house-keeping геном и с одним из исследуемых генов Реакционная смесь объемом 25.5 мкл включала в себя по 6 pmol (пикомоль) каждого из праймеров (сенс-праймер, антисенс-праймер); 9.3. мкл воды; 10 мкл реакционной смеси (Буфер Б); 5 мклкДНК, разведенной в 5 раз от исходной концентрации. Реакционная смесь для RT-PCR (ЗАО «Синтол», Россия) содержала 2.5х ПЦР Буфер Б (KCl, трисHCl (pH=8.8), 6.25 мМMgCl2), Taq-полимеразу, дезоксинуклеозидфосфат, глицерол, Tween 20, интеркалирующий краситель SYBRGreenI. При выполнении PCR соблюдались следующие условия: денатурация при 95° в течение 10 минут предшествовала 40 циклам амплификации по 35 секунд; каждый цикл состоял из 10 секунд денатурации при 95°, 15 секунд отжига при 60° и 20 секунд элонгации при 72°. Затем проводилось плавление полученной двуцепочечной ДНК (каждые 5 секунд температура повышалась с 72° до 95° с шагом в 1°) для построения кривых плавления, отражающих

56

специфичность проведенной PCR-реакции, т.е. отсутствие дополнительных неспецифических продуктов реакции.

Исследование параметров гемостаза.

Всем пациенткам, натощак, производился забор венозной крови перед хирургическим лечением или ЭМА, через 48 часов и семь суток в пробирки для исследования параметров свертывания Vacuette (Grreiner Bio-One, Австрия), содержащих 3,2% (0,109 моль/л) забуференный раствор цитрата натрия. Соотношение в пробе составляло на 1 часть цитрата натрия 9 частей крови.

Данное исследование включало в себя определение фибриногена (г/л), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ, сек.), протримбинового индекса (ПТИ, %), тромбиновое время (ТВ, сек.) агрегации тромбоцитов (%), МНО (у.е), растворимые фибринмономерные комплексы (РКМФ, мг%), Д-димер (мкг/мл), волчаночный антикоагулянт (ВА,усл.ед.), протеин С (%). Все исследования проводились на автоматическом коагулографе ACL-7000 (IInstrumentation Laboratory, США).

Для анализа микрогемодинамики проводилось исследование физикохимических свойств крови с использованием гемовискозиметра АНТАРЕС ВКА-0801 (Россия).

Рентгенологические методы исследования проводились по показаниям,

когда имелись основания для подозрения на распространение тромбоза глубоких вен нижних конечностей, ТЭЛА.

КТ-ангиопульнография (рентгеноконтрастное исследование лёгочных артерий с применением компьютерной томографии) с использованием контрастного вещества по системе отслеживания болюса.

Радионуклидная перфузионная сцинтиграфия легких, методика, которая основана на исследовании капиллярного легочного кровотока и имеющая высокую диагностическую ценность при тромбоэмболии, различных острых и хронических легочных заболеваниях. Принцип данной

57

методики основан на “застревании” радиоактивных частиц в прекапиллярных артериолах или капиллярах легких с временной эмболизацией капиллярного русла. Их распределение пропорционально регионарному легочному кровотоку. Для перфузионной сцинтиграфии легких используется препарат МАКРОТЕХ,99мТc - радиофармацевтический препарат диагностического назначения. Представляет собой макроагрегаты альбумина, меченые технецием-99м, которые вводят внутривенно 80-120 мл, в зависимости от веса пациента. Исследование проводилось в Гамма-камера BrightView,

Philips

Ангиопульмонографическое исследование производили в клинике факультетской хирургии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, под руководством академика РАН, д.м.н., профессора В.С.Савельева на ангиокардиографическом аппарате Siemens Axiom Artis dTC/TC.

Оценка дневников мочеиспускания.

В качестве объективных стандартных тестов определения степени тяжести недержания мочи, предложенных Международным обществом по удержанию мочи (International Continence Society, I.S.C., 1989), пациенткам с различными формами недержания мочи (стрессовое, ургентное недержание мочи и гиперактивный мочевой пузырь) необходимо ведение дневников мочеиспусканий. К тестам относятся: количество эпизодов недержания мочи за неделю (N-0); количество прокладок, используемых за неделю (N-0); частота дневных (N-7-8) и ночных (N-0-2) мочеиспусканий.

Комплексное уродинамическое обследование (КУДИ).

С целью оценки функционального состояния мочевого пузыря мочеиспускательного канала, а также анализа параметров мочевыделения и мочеиспускания, пациенткам произведено комплексное уродинамическое обследование, включающее цистоманометрию и профилометрию. Комплексное уродинамическое обследование осуществлялось на базе кафедры урологии и оперативной нефрологии лечебного факультета ГБОУ

58

ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой д.м.н. профессор С.П. Доренков).

Для проведения комплексного уродинамического исследования использовали комплекс аппаратуры Andromeda (Holland). Профилометрия уретры выполнялась при помощи специального измерительного катетера № 5 по Шарьеру.

Уродинамические методики, терминология, единицы измерения и диагностические критерии соответствуют разработкам и рекомендациям

International Continence Society (I.S.C., 1989), (Международное общество по удержанию мочи). Полученные данные сравнивали со стандартными показателями уродинамики здорового контингента, учитывая рекомендации

I.S.C.

Для определения типа недержания мочи использовались Международная классификация, предложенная и модифицированная McGuire E. и Blaivas J. в 1988 году. Данная классификация рекомендована к применению I.S.C. и является общепринятой.

Для определения степени тяжести недержания мочи в клинической практике не менее широко применяется более простая классификация Д.В.Кана (1978), определяющая степень недержания мочи при напряжении, также приемлемая для практического здравоохранения.

Цистоманометрия – метод, позволяющий регистрировать величину внутрипузырного давления в фазе наполнения мочевого пузыря и в фазе его опорожнения, и оценивать сократительную способность мышц мочевого пузыря. Цистоманометрия позволяет регистрировать взаимосвязь объема мочевого пузыря и давления в нем во время его наполнения. При искусственном введении жидкости (физиологический раствор) по уретральному катетеру для наполнения мочевого пузыря цистометрия называется ретроградной. Регистрация показателей цистометрии при наполнении мочевого пузыря вследствие поступления мочи из верхних

59

мочевых путей получило название антеградной цистометрии. Перед исследованием пациентка осуществляет самостоятельное мочеиспускание, после чего производят катетеризацию мочевого пузыря и измеряют количество остаточной мочи. Мочевой пузырь заполняют жидкостью с одновременным измерением внутрипузырного давления; пациентка должна сообщать о своих ощущениях во время обследования в интересах получения достоверных результатов. По мере заполнения мочевого пузыря появляются первые признаки его наполнения в виде незначительного позыва на мочеиспускание, что находит свое отражение на цистометрической кривой (первое ощущение (ПО), в норме наступает при объеме 150 -250 мл; давление в пузыре в это время 10 – 15 см Н2О). Далее, когда желание будет сильным до невозможности терпеть, что также находит свое отражение на кривой (максимальный цистометрический объем мочевого пузыря (МЦОМП), в норме от 250 до 350 мл у женщин), инфузия прекращается. Для выявления нестабильности детрузора возможно проведение цистоманометрии с провокационными пробами: изменение положения пациентки, кашель.

Измерение внутрипузырного давления во время наполнения мочевого пузыря позволяет оценить его резервуарную функцию: физиологическую емкость, максимальную емкость, податливость (растяжимость) стенки мочевого пузыря, которая является отношением изменения объема наполнения мочевого пузыря к изменению внутрипузырного давления.

Способность детрузора растягиваться в ответ на поступление жидкости в мочевой пузырь и поддерживать в нем давление на уровне, не вызывающем сокращение мочевого пузыря получило название адаптационной способности мочевого пузыря или комплианса. В мочевом пузыре со сниженным комплиансом увеличение объема вызывает повышение давления, в то время как при повышенном комплиансе увеличение объема вызывает минимальное увеличение давления. В норме при поступлении 20 мл мочи внутрипузырное давление не должно повышаться больше, чем на 1 см Н2О.

60