Работа 1. Определение реакции среды молока и яйца с помощью универсальной индикаторной бумаги

Универсальную индикаторную бумажку (пропитана универсальным индикатором) опустить в исследуемый материал, затем вынуть, сравнить с цветной шкалой для этого индикатора. И одна из ее окрашенных полосок, которая совпадает по интенсивности с окраской использованной универсальной индикаторной бумажки, обозначает величину рН биоматериала. Если универсальная бумажка по цвету располагается между двумя полосками шкалы, то за величину рН исследуемого биоматериала взять среднее из суммы значений рН этих полосок.

Точность метода до 0,5.

Задание: выполнить опыт, определить величину рН молока и яйца, сделать вывод о реакции среды.

Работа 2. Определение реакции среды бесцветных растворов с помощью прибора Михаэлиса

В прибор Михаэлиса входят:

1. Универсальный индикатор, имеющий область перехода рН от 4 до 8.

2. Четыре основных индикатора:

альфа-динитрофенол, имеющий зону перехода от 2,8 до 4,4%;

гамма-динитрофенол, имеющий зону перехода от 4,0 до 5,4;

пара-нитрофенол, имеющий зону перехода от 5,4 до 7,0;

мета-нитрофенол, имеющий зону перехода от 6,8 до 8,4.

3. Четыре ряда растворов эталонов в ампулах, на которых ука-

зана величина рН. Каждому из 4 основных индикаторов соот-

ветствует свой цветной ряд эталонов.

4. Фарфоровая чашка.

5. Пипетка для взятия основных индикаторов.

6. Цветная таблица для универсального индикатора.

7. Компаратор Уолполя с шестью пробирками.

Ход опыта

Исследование ведется в два этапа. Целью 1-го этапа является выбор основного индикатора.

В фарфоровую чашку налить 3 мл исследуемого бесцветного раствора и 3 капли универсального индикатора. Появившуюся окраску раствора сравнить с цветной шкалой и найти приблизительное значение рН этого раствора. По этой величине рН, используя данные о зонах перехода индикаторов (см. пункт 2 выше), выбрать основной - индикатор, в зоне которого находится рН данного раствора. Этот индикатор используют во 2-м этапе опыта.

Цель 2-го этапа - определить рН раствора с точностью до 0,1. Для этого в пробирку компаратора Уолполя налить из флакона 3 мл того же исследуемого раствора и добавить 0,5 мл основного индикатора. Пробирку поставить в среднее гнездо компаратора и подобрать для нее из одноименного с выбранным в 1-м этапе основным индикатором ряда эталонных растворов одинаковый по окраске эталон. Он и обозначает величину рН раствора. Если цвет исследуемого раствора слабее этого эталона, но темнее другого (соседнего), то в расчет надо взять среднее значение рН из их суммы.

Задание: определить рН бесцветного раствора аминокислоты универсальным и основным индикаторами и сделать вывод о его реакции.

Работа 3. Определение рН гомогената мышечной ткани, раствора яичного белка с помощью прибора Михаэлиса Приготовление гомогената из тканей животных

Свежую ткань печени или мышц предварительно многократно промывают 0,9 % - ным раствором NaCl (физиологический раствор), охлажденным до 0^оС, а затем обсушивают фильтровальной бумагой и измельчают ножницами. На весах взвешивают измельченную ткань и помещают в стакан для гомогенизирования. В случае, если используется стеклянный гомогенизатор, зазор между стенкой и пестиком должен быть 0,2 – 0,3 мм; скорость вращения пестика не должна превышать 800 об/мин. Время измельчения тканей: печень – 30 – 40 сек, мышцы – до 60 сек. Если используют механический гомогенизатор, скорость вращения ножей можно доводить до 900 об/мин. Все работы необходимо проводить на холоде, помещая стакан гомогенизатора в чашку со льдом.

Разбавление при гомогенизировании должно проводиться с учетом содержания определяемого биологически активного вещества. Так, в случае определения активности алкогольдегидрогеназы в печени используют разбавление 1:3 или 1:5 (на 1г сырой ткани добавляют 3 или 5 мл охлажденной среды выделения).

Полученный тканевой гомогенат центрифугируют при 5000 g в течение 10 – 15 мин (t = 0^оС). Надосадочную жидкость (супернатант) подвергают биохимическим исследованиям.