Работа 21. Определение количества аминокислот в биоматериале по азоту аминогрупп методом формольного титрования по Серенсену

Моноамино-монокарбоновые аминокислоты, содержащие одновременно основную аминную и кислую карбоксильную группы, в водных растворах показывают нейтральную реак­цию. На основании этого считают, что в аминокислотах ами­ногруппа и карбоксильная группа нейтрализуют друг друга.

Таким образом, аминокислоты в водных растворах облада­ют характером внутримолекулярных солей, и, следовательно, непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно.

При взаимодействии аминокислот с формальдегидом ами­ногруппа реагирует с последним и образуются производные аминокислот; при этом аминогруппы теряют свои основные свойства:

NH₂ N = CH₂

R — СН + СНОН  R — СН + H₂O

СООН COOH

метиленаминокислота

Карбоксильные же группы в метиленаминокислотах сохраня­ются без изменения и в этом случае могут быть оттитрованы щелочью: N = CH₂ N = CH₂

R — СН + NaOH  R — СН + H₂O

COOH COONa

Количество титруемых при этом карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Таким образом, результат титрования указывает на содержа­ние аминных групп.

Метод основан на блокировании аминогруппы (-NH₂) аминокислоты формальдегидом и оттитровывании оставшей­ся свободной карбоксильной группы (-СООН) щелочью. По расходу последней определяют количество азота NH₂-группы, а по нему рассчитывают содержание аминокислоты в растворе или белке. Этим методом можно определить только содержание нейтральных аминокислот.

Ход опыта

Налить в колбочку 10 мл формольной смеси (состоит из 30 - 40% раствора формалина и нескольких капель 0,1% раствора фенолфталеина) и оттитровать ее (в ней могут быть кислотные примеси) 0,1н раствором NaOH до слабо-розовой окраски, не учитывая количество щелочи.

Затем в эту же колбочку влить 10 мл исследуемой вытяжки из мяса (животных или рыбы) и оттитровать ее содержимое 0,1н раствором NaOH до ярко-красного цвета. Отметить расход 0,1н раствора NaOH на титрование и произвести вычисление.

Расчет. Во-первых, надо найти количество мг азота NH₂-групп в 10 мл исследуемой вытяжки аминокислоты. Для этого количество мл 0,1н раствора NaOH, пошедшего на титрование раствора аминокислоты (например, 5 мл), следует умножить на 1,4 мг (это количество мг азота, соответствующее 1 мл 0,1н раствора NaOH).

5  1,4 = 7 мг азота аминогрупп в 10 мл исследуемого раствора аминокислоты.

Зная М. м. исследуемой аминокислоты, можно по найденному количеству азота ее NH₂-групп определить содержание аминокислоты. Например, определяемая аминокислота глицин (NН₂СН₂СООН). Его М. м. равна 75 мг/моль, а количество азота в нем 14 мг. Следовательно, 14 мг азота образуют 75 мг глицина, а 7 мг азота (вычислено выше) образуют Х мг глицина. Отсюда,

мг глицина в 10 мл вытяжки из мяса.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Определить количество мг азота NH₂-групп аминокислоты в 10 мл вытяжки из мяса.

3. Написать структурную формулу, вычислить М. м. исследуемой аминокислоты и по содержанию азота ее аминогрупп вычислить количество аминокислоты в 10 мл вытяжки.

4. Указать биороль аминокислоты.

5. Объяснить принципы и технологию опыта. Написать реакцию аминогруппы аминокислоты с формальдегидом.