Работа 19. Определение белка по методу Лоури

Метод основан на измерении интенсивности окраски белков, с помощью фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. Метод очень чувствительный, так как позволяет определять от одного до нескольких мкг белка в пробе. При этом белки образуют окрашенные комплексы при одновременном протекании биуретовой реакции и реакции восстановления белками реактива Фолина (смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно - молибденовой кислот образует с белками комплексное соединение синего цвета).

Для определения готовят следующие реактивы: А — 2% раствор углекислого натрия в 0,1 Н растворе NaOH; Б - 0,5% раствор сульфата меди в 1 % растворе лимоннокислого на­трия; перед употреблением смешивают реактивы Б и А в соотношении 1:50 и получают реактив В;

Фолина - Чокальтеу - в 700 мл дистиллированной во­ды растворить 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия. Затем прилить 50 мл 85% раствора ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной НСl. Смесь осторож­но кипятить с обратным холодильником 10 - 12 ч. Потом до­бавить в нее 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 5 - 6 ка­пель брома. Снова прокипятить 10 - 15 мин без обратного холодильника для удаления избытка брома. После охлажде­ния довести объем раствора до 1 000 мл. Он должен быть прозрачным (в противном случае его отфильтровать через стеклянную вату), ярко-желтого цвета. Раствор Фолина от­титровать 0,1н раствором NaOH по фенолфталеину и на основании результатов титрования развести водой до 1 Н кон­центрации. Хранить в темной посуде.

Ход опыта

К 0,1 мл гомогената мышечной ткани прилить 9 мл реактива В, пере­мешать и оставить стоять на 10 мин при комнатной темпера­туре. Потом к смеси прилить 0,9 мл реактива Фолина - Чо­кальтеу, перемешать. Через 30 мин провести фотоколоримет­рию (или спектрофотометрию) при длине волны 750 нм, сравнивая исследуемый раствор с контролем, в который вме­сто гомогената взять 0,1 мл дистиллированной воды, при­лить все остальные реактивы. На ФЭКе или СФ найти опти­ческую плотность исследуемого раствора.

Расчет содержания белка произвести по калибровочному графику, который надо построить заранее, используя стан­дартный раствор бычьего альбумина. На оси абсцисс ука­зывают содержание белка в пробе (мкг), на оси ординат - оптическую плотность (Д) исследуемого раствора.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Определить содержание белка в гомогенате мышечной ткани и сравнить его с нормой для этого животного. В случае откло­нения от нормы указать предполагаемые причины, послед­ствия и пути их устранения.

Работа 20. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге

Метод основан на различии адсорбционных свойств и растворимости аминокислот в системе органический растворитель/вода при их продвижении по хроматографической бумаге.

Метод применяют для качественного и количественного определения аминокислот в белках тканей, органов, кормах и свободных аминокислот в биологических жидкостях.

Распределительная хроматография может быть нисходящая, восходящая и круговая.

При восходящей хроматографии полоска бумаги, с нанесенной на нее каплей раствора аминокислот, погружается в ванночку с растворителем, находящуюся на дне камеры (рис.5). Растворитель при этом движется снизу вверх, увлекая с собой аминокислоты. Они движутся по бумаге с различной скоростью, зависящей от их физико-химических свойств.

При достижении фронта растворителя линии финиша, бумажку вынимают из хроматографической камеры, просушивают и опрыскивают раствором нингидрина, с которым аминокислоты образуют комплексы, окрашенные в лиловый цвет.

Рис. 2. Восходящая хроматография ами- нокислот в пробирке: 1 – полоска хроматографической бумаги, 2 – место нанесения образца, 3 - растворитель

Ход работы

Взять полоску хроматографической бумаги размером 110 см. Расположить ее на чистом листе обыкновенной бумаги и, отступя 1 см от нижнего края полоски, провести простым карандашом линию старта. Обозначить в ее сере­дине диаметром 1 мм кружок, куда нанести микропипеткой 0,05-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Пятно подсушить на воздухе. Затем полоску за противоположный край подвесить на крючок пробки хроматографической камеры, подтянуть за проволочку к пробке, с которой опустить в камеру до соприкосновения с растворителем (3), но чтобы линия старта была выше его. Если бумажка не достает до поверхности растворителя, то ее опустить, нада­вливая на проволоку в пробке, которой надо плотно закрыть камеру. Последнюю поставить в термостат при 35 - 40°С, находящийся под вытяжным шкафом. При достижении фрон­та растворителя линии финиша бумажку вынуть (каме­ру опять закрыть плотно пробкой) подвесить на крючок и подсушить при 105°С в сушильном шкафу. После этого хроматограмму взять за верхний край и смочить, протягивая в 0,1% спиртовом растворе нингидрина, налитом в чашку Пет­ри или часовое стекло, и снова подвесить на крючке в су­шильный шкаф. При реакции с нингидрином проявляющиеся пятна аминокислот приобретают лиловую окраску. Опытную хроматограмму сопоставить со стандарт­ной, на которой нанесены известные аминокислоты. Одно­именные аминокислоты на этих хроматограммах располага­ются на равном расстоянии от линии старта и финиша.

Задание: 1. Выполнить опыт.

2. Зарисовать хроматографическую камеру (рис. 2).

3. Определить, какие аминокислоты находятся в исследу­емом растворе. Написать их структурные формулы и указать биороль.

4. Объяснить принцип и технологию хроматографического метода разделения аминокислот.