Молекулярная биология.

1. Механизмы трансляции (биосинтез белка): инициация, элонгация и терминация. Роль ГТФ в биосинтезе белка. Функциональная роль рибосомы. Регуляция трансляции у прокариот и эукариот.

1. Синтез белка отличается от других матричных биосинтезов тем, что между матрицей и продуктом нет комплементарного соответствия. Поскольку матрица построена из 4 нуклеотидов, а продукт, полипептидная цепь. - из 20 аминокислот, суще­ствует определенный закон шифрования амино­кислот в нуклеотидной последовательности матри­цы, т.е. биологический код.

2. Биологический код - это способ записи инфор­мации об аминокислотной последовательности белков с помощью последовательности нуклеоти­дов в ДНК или РНК. Он характеризуется следую­щими свойствами: триплетнослъю, специфичностью, универсальностью, наличием терминирующих кодонов, вырожденностью.

3. События на рибосоме включают этапы иници­ации, элонгации и терминации. Инициация начинастся с присоединения к малой субъединице ри­босомы факторов инициации, комплекса Мет-тРНК^Мет с GTP и мРНК в области кэпа и иниции­рующего кодона AUG. После связывания антикодона Мет-тРНК^Мет с кодоном AUG проис­ходит присоединение 40S-субъединицы рибосомы, сопровождающееся гидролизом GTP и отделением факторов инициации. Формируются 40S-рибосома, у которой Мет-тРНК^Мет находится в Р (пептидильном)-центре, а А (аминоацильный)-центр свобо­ден.

4. Этап элонгации включает три последователь­ные стадии. Связывание аа-тРНК в А-центре. В рибосому, у которой в Р-центре находится Мет-тРНК^Мет, в А-центр присоединяется первая аа-тРНК. Выбор аа-тРНК определяется строением кодона мРНК, поскольку между кодоном мРНК и антикодоном тРНК возникает комплементарное взаимодейст­вие. Связывание аа-тРНК с мРНК происходит с использованием энергии GTP и при участии фак­тора элонгации EF1.

Образование пептидной связи. Первая пептидная связь возникает за счет реакции транспептидации, в ходе которой метионин от инициаторной тРНК переносится на а-аминогруппу аа-тРНК в А-центре с образованием дипептилил-тРНК. Катализиру­ет пептидилтранеферазную реакцию рРНК боль­шой субъединнцы рибосомы.

Транслокация. В ходе этой стадии за счет энер­гии GTP и при участии фактора элонгации EF2 рибосома перемешается на один кодон в направ­лении от 5'- к 3'-концу мРНК. В результате дипептидил-тРНК из А-центра попадает в Р-центр, а в А-центре оказывается следующий кодон. тРНК^Мет покидает рибосому. Далее процесс про­должается по описанной схеме, повторяя стадии: 1->2->3.

5. Терминация трансляции происходит после включения в А-центр одного из колонов терминации: UAG, UGA, UAA. При участии специальных белков - факторов терминации RFI, RF2 и KF3 - происходит гидролитическое отщепление синтези­рованного полипептида от тРНК. тРНК высвобож­дается из рибосомы за счет гидролиза GTP, и «пус­тая» рибосома легко диссоциирует на субъединицы.

6. В процессе трансляции малая и большая субъ­единнцы рибосомы выполняют разные функции: малая субъелнница присоединяет мРНК и декоди­рует информацию с помощью тРНК и механизма транслокации, большая субъединица ответственна за образование пептидных связей. Основной вклад в организацию и проявление пептидилтрансферазной активности вносит рРНК.

Механизмы регуляции. Адаптация организмов к различным воздейст­виям окружающей среды осуществляется, в частности, путем изменения экспрессии (активности) ге­нов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непо­средственной близости от стартового участка транскрипции. Эукариотическис клетки использу­ют этот же принцип, хотя в регуляции экспрессии генов реализуются и некоторые другие механизмы.

1. У прокариот определенные белки связыва­ются с регуляторными участками оперона и пре­дотвращают или усиливают связывание РНК-полимеразы с промотором.

3. В клетках млекопитающих существуют два ви­да регуляции биосинтеза белков: а) кратковременная, обеспечивающая адаптацию организма к возможным изменениям окружа­ющей среды; б) длительная, стабильная, определяющая дифференцировку клеток и разный белковый со­став органов и тканей.

4. Адаптивная регуляция у высших организмов от­личается от регуляции транскрипции у прока­риотов многообразием сигналов, которые контро­лируют не только начало процесса на молекуле ДНК, но и частоту, с которой он происходит. ТАТА-участок промотора присоединяет TA­TA-связывающий белок, факторы транскрипции А и В, которые обеспечивают взаимодействие с РНК-полимеразой и определяют стартовую точку транскрипции. Минимальный синтез мРНК становится возможным после связывания РНК-полимеразы с транскрипционными факторами F, Е, Н.

2. Физико-химические особенности РНК. Транскрипция: механизмы, регуляция. РНК-полимеразы прокариот и эукариот. Процессинг и сплайсинг первичных транскриптов. Обратная транскрипция.

Рибонуклеиновые кислоты. Мономером является нуклеотид, состоящий из 1 азотистого основания /А, Г, Ц, У/, сахара-рибозы и 1 остатка фосфорной кислоты.

Мономеры – нуклеотиды соединяются друг с другом прочными ковалентными связями/рибоза одного нуклеотида с остатком фосфорной кислоты другого/в одноцепочечный полимер. Выделяют 3 вида РНК: рибосомальная, информационная (матричная) и транспортная. Они имеют различную величину, структуру и функции. Рибосомальная РНК (р-РНК) служит субстратом для синтеза, имеет молекулярный вес 1-2 млн., число нуклеотидов – до 5000. Различают 2 стабильные формы – легкую и тяжелую. Из легких цепей р-РНК формируется строма (каркас) малых субъединиц рибосом, из тяжелых – строма больших субъединиц. Рибосомальная РНК не транслируется. Информационная РНК (и-РНК) составляет около 5% всей клеточной РНК. Она образуется на участках цепи ДНК, несет информацию о структурных и регуляторных белках организма. Зрелая и-РНК на 5’ конце несет белковую «шапочку» (КЭП), на 3’-полиадениновый «хвост» из нескольких десятков оснований. Она выходит через поры ядра в цитоплазму. В цитоплазме и-РНК может накапливаться в виде информосом. Транспортная РНК составляет около 10 % всей клеточной РНК. Зрелая т-РНК имеет 78-85 нуклеотидов. На 5’ конце она всегда имеет гуанин, на 3’-триплет АЦЦ. Первичная структура т-РНК – одинарная цепь нуклеотидов. Вторичная напоминает клеверный листок с 4 спиральными участками – «шпильками», где спарены комплементарные нуклеотиды А=У, Г-Ц. На концах «шпилек» находятся одноцепочечные петли. В нижней петле расположен антикодон-триплет, комплементарный кодону м-РНК. Третичная структура т-РНК возникает в результате складывания боковых «шпилек» и взаимодействия дополнительных оснований. Функция т-РНК – перенос из клетки в рибосому аминокислот. т-РНК несет две функции:1. Расшифровку кодона и и-РНК. 2. Расшифровку и перенос соответствующей а/к.

Транскрипция. Синтез РНК на ДНК-матрице называется транскрипцией. Образованные первичные транс­крипты мРНК, тРНК, рРНК комплементарны ма­тричной цепи ДНК (3',5'-цепь). Субстратами и источниками энергии для син­теза РНК являются рибонуклеозиды и фосфаты (ATP, OTP, СТР. UTP). Катализируют синтез РНК ферменты РНК-полимеразы. В ядрах эукариотов обнаружены 3 спе­циализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая рРНК; РНК-поличераза II, ответственная за синтез мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая тРНК. Область связывания (специфическая последовательность ДНК) РНК-полимеразы с матри­цей называется промотором. Завершается синтез, когда РНК-полимераза достигает терминирую­щей последовательности (сайт терминации). Уча­сток ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации, представляет собой единицу транс­крипции. У эукариотов в состав транскриптона входит только один ген. Существование на молекуле ДНК множества транскриптонов позволяет с разной активностью проводить индивидуальное считывание (транс­крипцию) разных генов. РНК-полимераза - фермент, состоящий из не­скольких субъединиц, имеющий несколько цент­ров связывания регуляторных факторов.

В процессе транскрипции различают три ста­дии: инициацию, элонгацию и терминацню.

Активация промотора происходите помощью белкового фактора (ТАТА-фактора), который по­лучил свое название потому, что взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора TATA. Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Присоединение РНК-полимеразы к промотору увеличивает сродство фермента к факторам инициации (А, В), которые иницииру­ют раскручивание примерно одного витка двой­ной спирали ДНК. Факторы элонгации (Е, Н, F) повышают ак­тивность РНК-полимеразы и облегчают локальное расхождение нуклеотидных цепей. Синтез молекулы РНК идет от 5'- к 3'-концу комплемен­тарно матричной цени ДНК. По мере продвиже­ния РНК-полимеразы по цепи ДНК (3',5'-цепь) впереди нее происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали. Терминация. Расхождение двойной спирали ДНК в облас­ти сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Транскрипция прекращает­ся, когда РНК-полимераза достигает сайта тер­минации. Фактор терминации облегчает отделе­ние первичного транскрипта от матрицы. Образованная нуклеиновая кислота комплемен­тарна матрице.

Модификации мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина пер­вичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидов, происходит кэпирование его 5’-конца. Остаток GTP присоединяется своим 5'-концом к 5'-концу фрагмента с образованием 5',5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилированис гуанина в составе GTP завершает образование кэпа. Первичный транскрипт комплементарному гену, содержит как экзоны, так и нитроны. Последователь­ности интронов вырезаются из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом; такая модификация РНК называется сплайсингом. Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму пере­носится уже зрелая мРНК.

Созревание мРНК включает сле­дующие этапы: 1) кэпированис 5'-конца; 2) присоединение полиА-фрагмента к 3'-концу; 3) сплайсинг (удаление интронов).

В процессе посттранскрипционных модифи­каций первичных транскриптов тРНК на 3'-конце молекул формируется акцепторный участок (-ССА) для присоединения аминокислот, а в средней части молекул - антикодон - триплет нуклеотидов, обеспечивающий взаимодействие тРНК с кодоном мРНК.

3. Физико-химические особенности ДНК. Понятие о геноме. Механизмы репликации ДНК и их регуляция. Белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК (полимеразы, праймаза, хиликазы, топоизомеразы, лигазы, SSB-белки). Понятие репликона. Регуляция репликации у прокариот и эукариот.

Из всех НК ДНК имеет наибольшее значение. О ее ведущей роли свидетельствуют: 1) основное место локализации – ядро; в небольших количествах ДНК содержится в митохондриях, центросоме, пластидах – органоидах, способных к самовоспроизведению; 2) каждому виду свойственно постоянство числа хромосом; 3) только в половых клетках в результате гаметогенеза число хромосом уменьшается вдвое; 4) мутагены в первую очередь действуют на ДНК, а потом – на остальные компоненты клетки.

Строение ДНК. Мономером ДНК является нуклеотид, как и у любой нуклеиновой кислоты. Нуклеотиды ДНК содержат: 1 остаток фосфорной кислоты, сахар – дезоксирибозу, азотистыое основаниие (А, Т, Ц, Г). Первичная структура ДНК: образуется, как и у РНК, путем соединения нуклеотидов в одноцепочечный полимер. При этом ковалентные связи образуются между углеводом одного нуклеотида и остатком фосфорной кислоты другого. Вторичная структура образуется путем соединения двух полинуклеотидных цепей между собой. Соединение идет по 2 принципам – комплементарности и антипараллельности. Принцип комплементарности (А=Т, Г=Ц) осуществляется следующими факторами: 1) пространственной конфигурацией молекул оснований: форма аденина повторяется формой тимина, форма гуанина - формой цитозина; 2) водородными связями А=Т (две), Г=Ц (три), т.к основания либо 2-, либо трехвалентны; 3) силами Ван-дер-Ваальса (межмолекулярные связи, возникащие у макромолекул). Принцип антипараллельности, определяющийся особенностями химических связей между углеводом и остатком фосфорной кислоты, приводит к тому, что считывание информации с каждой из двух цепей идет в разных направлениях. Начало считывание принято обозначать знаком 5’,конец-3. Двойная цепь ДНК закручена вокруг своей оси в среднем по 34,6 на один нуклеотид. Диаметр спирали 2 нм, шаг винта 3,3 нм. Каждый виток содержит 10 пар нуклеотидов, так что на пару нуклеотидов приходится 0,34 нм по оси. По всей длине каждой метафазной хромосомы проходит непрерывная плотно уложенная двойная спираль ДНК. Первый шаг компактизации хромосом – образование нуклеосом. Нуклеосома – это ДНК-гистоновый комплекс, который выглядит как частица дисковидной формы диаметром 11 нм. Каждая нуклеосома состоит из белкового кора или октамера и 2 оборотов фрагмента двухцепочечной ДНК. Белковый кор (сердцевина) содержит набор из 4 пар гистоновых белков Н2А, Н2В, Н3, Н4. Это самые консервативные белки в любом геноме. Они одинаковые у гороха и у человека. На этот белковый кор накручивается фрагмент двухцепочечной ДНК.

Репликация - матричный процесс. Во время репликации каждая из 2 цепей ДНК служит матри­цей для образования новой цепи. Субстратами и источниками энергии для син­теза ДНК являются дезокси-рибонуклеозид-трифосфаты - dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Ферменты, катализирующие процесс реплика­ции, объединены в мультиферментный комплекс. Основные этапы процесса: I - формирование рспликативной вилки; II - синтез новых цепей ДНК; III - исключение праймеров. Завершение формирования отстающей цепи ДНК.

Формирование репликативной вилки идет при участии: ДНК-топоизомеразы, которая является обратимой нуклеазой. Сначала она разрывает цепь (3',5'-фосфодиэфирную связь) ДНК, а по окончании репли­кации зашивает временные надрезы. Такие времен­ные разрывы цепи ДНК облегчают образование и продвижение репликативной вилки;

ДНК-хеликазы - ДНК-зависимой АТРазы, ис­пользующей энергию АТР для расплетения двой­ной спирали ДНК; белков, дестабилизирующих спираль (или SSВ-бел­ков). SSВ-белки, не закрывая оснований, связываются с одноцепочечной ДНК и этим предотвращают образование «шпилек» и ком­плементарное скручивание матричных цепей.

Синтез. ДНК-полимераза S (дельта) не способна иници­ировать синтез новых цепей ДНК, она может лишь удлинять уже имеющуюся нуклеотншгую цепь - за­травку (праймер). Роль затравки выполняет РНК, синтезируемая специальным ферменгом ДНК-полимеразой а (альфа). Каждый праймер состоит при­мерно из 10 нуклеотидов. ДНК-полимераза, активируемая праймером, продолжает синтез новой непрерывной цепи в на­правлении от 5'- к 3'-концу по ходу раскручивания репликативной вилки (лидирующая цепь). На другой матричной цепи ДНК-полимераза а и ДНК-полимераза е (эпсилон) ведут синтез отстающей цепи (фрагментов Оказаки) против движения репликативной вилки. Каждый фрагмент Оказаки состоит примерно из 100 нуклеотидов. Каждый фрагмент Оказаки содержит праймер, который удаляет ДНК-полимераза р (бета), посте­пенно отрезая от 5'-конца фрагмента по одному рибонуклеотиду. К 3'-концу фрагмента ДНК-поли­мераза р присоединяет дезокси-рибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру, запол­няя образованную брешь. ДНК-лигаза соединяет фрагменты запаздывающей цепи ДНК.

В активном центре всех ДНК- и РНК-полимераз находится ион Zn²⁺ (кофактор фермента). Для взаимодействия полимераз с субстратами необхо­димо присутствие также ионов Mg²⁺. Mg²⁺ поляри­зует нуклеотиды, образуя с ними комплексы, и по­вышает их реакционную способность.

8. Молекула ДНК человека имеет очень большие размеры, репликация такой большой молекулы (скорость 50 нуклеотидов в минуту) шла бы в тече­ние примерно 800 ч. Поэтому инициация синтеза ДНК происходит в нескольких точках хромосомы, которые называются точками инициации реплика­ции, или ориджинами (origin) репликации. Ориджины репликации имеют определенную нуклеотидную последовательность. Единица репликации у эукариотов называется репликомом. На ориджинах инициируется двунаправленная репликация, т.е. об­разуются 2 репликативные вилки, перемешающиеся в противоположных направлениях до тех пор, пока не встретятся со следующим репликоном.

По завершении репликации образуются 2 мо­лекулы двухспиральной ДНК, каждая из которых содержит одну материнскую и одну дочернюю, вновь синтезированную нить (полуконсерватив­ный механизм). В результате митоза они поступа­ют в дочерние клетки. Таким образом, репликация обеспечивает воспроизведение генотипа в новых поколениях.

Репликация происходит в S-фазу клеточного цикла. В регуляции клеточного цикла участвуют белки циклины. Различают циклины А, В, D, Е. Циклины являются активаторами циклинзависимых протеинкиназ, которые в активной форме мо­гут фосфорилировать специфические белки, уча­ствующие в подготовке клетки к делению. Синтез каждого циклима начинается при подготовке к со­ответствующей фазе клеточного цикла, его кон­центрация в клетке повышается и после заверше­ния фазы резко падает до нуля.