5.5.Определение содержания глюкозы ферментативным методом

Принцип метода: глюкоза окисляется в присутствии глюкозооксидазы согласно реакции:

Глюкоза + О₂ → глюконолактон + Н₂О₂.

Образующаяся перекись водорода под действием пероксидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта, оп­ределяемого фотометрически.

Ход исследования глюкозы в плазме, сыворотке крови или в моче. Длина волны 510 нм (сине-зеленый светофильтр), кювета с рабочей шириной 10 мм. Компоненты в реакционной смеси отбирают в количе­ствах согласно данным таблицы.

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 15 мин при 37 °С при предварительно прогретом рабочем растворе. Измеряют оптическую плотность птной пробы А_оп и стандартной пробы А_ст против холостой пробы. Стабильность окраски 15 мин.

Отмерить, (мл)	Опытная проба	Стандарт	Холостая проба
Сыворотка, плазма, моча	0,01
Стандарт глюкозы		0,01
Дистиллированная вода			0,01
Рабочий реагент	1,00	1,00	1,00

Расчет концентрации глюкозы производят по формуле:

С_оп = А_оп × С_ст

где С_оп — концентрация в опытной пробе (ммоль/л); А_оп — оп­тическая плотность опытной пробы; А_ст — оптическая плотность стандарта; С_ст — концентрация стандарта (5,55 или 16,0 ммоль/л).

Определение концентрации глюкозы в цельной крови. Цельную кровь депротеинируют депротеинирующим реактивом (3% ТХУ). Перед употреблением содержимое флакона 3 разводят дистиллированной водой до 100 мл. Глюкозу определяют в надосадочной жидкости после центрифугирования. Объемы компонентов приведены в таблице.

Отмерить (мл)	Опытная проба		Стандарт	Холостая проба
Цельная кровь	0,05
Стандарт			0,05
Дистиллированная вода				0,05
Депротеинирующий раствор	0,5		0,5	0,5
Пробу перемешивают	1 центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин
Надосадочная жидкость	0,10	0,10		0,10
Рабочий реагент	1,00	1,00		1,00

Далее измерение проводят так же, как при анализе без депротеинирования. Расчет концентрации глюкозы производят по указанной выше формуле. В случае, когда оптическая плотность опытной пробы превышает 0,85, образец разводят дистиллиро­ванной водой в соотношении 1 : 1, а полученный результат ум­ножают на 2.

Клиническое значение

Уровень глюкозы в крови практически здоровых людей под­держивается в относительно постоянных пределах благодаря действию сложных физиологических механизмов нейрогуморальной регуляции, опосредующих свое влияние через ряд органов и тканей, прежде всего через печень — «центральную лабораторию» человеческого организма.У одного и того же человека в разные периоды суток концентрация глюкозы находится в пределах 3,3—6,7 ммоль/л. В норме натощак уровень глюкозы составляет 3,5—5,55 (6,1) ммоль/л. гиергликемия наблюдается при сахарном диабете, гиперфункции эндокринных желез, продуцирующих гормоны – антагонисты инсулина (болезнь Иценко-Кушинга, акромегалия, тиреотоксикоз, феохромоцитома). Алиментарные гипергликемии встречаются при избыточном употреблении углеводов. Гипогликемия чаще связана с абсолютным или относительным повышением уровня инсулина в крови.

Тема: Лабораторные исследования пигментного обмена.

Желчными пигментами называют продукты распада гемоглобина, миоголобина, цитохромов и гемсодержащих ферментов. К желчным пигментам относятся билирубин и уробилиноиды.

В норме в организме взрослого человека за один час разрушается 1-2×10⁸/л эритроцитов. Высвободившийся при этом гемоглобин превращается в вердоглобин, который разрушается на глобин и гем. Железо гема включается в общий обмен железа. Свободная от железа порфириновая часть гема подвергается метаболизму в микросомальной фракции ретикулоэндотелиальных клеток печени, селезенки и костного мозга сложной ферментативной системой – гемоксигеназой. К моменту поступления гема из гемовых белков в гемоксигеназную систему гем превращается в гемин. Гемин в результате ряда последовательных окислительно-восстановительных реакций метаболизируется в биливердин, который, восстанавливаясь под действием биливердинредуктазы, превращается в билирубин. Поскольку образовавшийся билирубин плохо растворим в плазме и воде, он доставляется в печень в специфически связанном с альбумином состоянии.

Дальнейший метаболизм билирубина в основном происходит в печени. Здесь происходит переход билирубина от альбумина к гепатоцитам. В гепатоцитах билирубин переходит из водонерастворимой формы в водорастворимую. Процесс называется коньюгацией. Сначала происходит образование билирубинмоноглюкуронида, а затем билирубиндиглюкуронида, который секретируется в желчь против весьма высокого градиента концентрации при участии механизмов активного транспорта. В составе желчи коньюгированный билирубин поступает в кишечник.

После того как билирубин достигает области подвздошной и толстой кишок, глюкурониды гидролизуются специфическими бактериальными ферментами. Далее кишечная микрофлора восстанавливает пигмент с последовательным образованием мезобилирубина и мезобилиногена (уробилиногена). Часть образовавшегося мезобилиногена (уробилиногена) всасывается через кишечную стенку, попадает в портальную вену и поступает в печень, где полностью расщепляется до дипирролов, поэтому в норме в общий круг кровообращения и мочу уробилиноген не попадает. Большая часть мезобилиногена (уробилиногена), образующегося в толстом кишечнике, окисляется в стеркобилиноген (уробилин), который в нижних отделах толстого кишечника окисляется до стеркобилина и выделяется с калом. Лишь небольшая часть стеркобилиногена всасывается в нижних отделах толстого кишечника в систему нижней полой вены и выводится почками с мочой. Следовательно моча человека содержит в норме следы стеркобилиногеа (уробилина), но не уробилиногена ( мезобилиногена).

Важнейшие пигменты — порфирины, хромопротеиды, меланины, каротиноиды, флавоны и др. Такие хромопротеиды, как гемоглобин, миоглобин, каталаза, цитохромы, в качестве простетической (т. е. небелковой) группы содержат железопорфириновый комплекс (гем). Образование гемоглобина происходит в гемопоэтических клетках костного мозга; миоглобин образуется, по-видимому, внутри мышечных волокон, а цитохромы и каталаза непосредственно в содержащих их тканях. При биосинтезе порфиринсодержащих пигментов сначала происходит синтез протопорфирина (из янтарной кислоты и глицина), в который затем включается атом железа, и в результате образуется гем. После присоединения к нему соответствующего белка завершается синтез того или иного хромопротеида. В процессе биологического распада порфириновых белковых пигментов высвобождаются железо и белок, а протопорфирин превращается в желчные пигменты.

В цепи реакций биосинтеза и превращений пигментов могут возникнуть патологические нарушения, ведущие к тяжелым заболеваниям. Так, при блокировании некоторых стадий биосинтеза порфириновых пигментов наступает порфирия, сопровождаемая анемией (резкое уменьшение образования гемоглобина) и порфиринурией (выделение с мочой промежуточных продуктов пигментного обмена). Во всех случаях гемолиза усиливается распад гемоглобина. Под влиянием некоторых ядов (например, цианида, окиси углерода) может происходить окисление гемоглобина с образованием метгемоглобина.

1.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ.

1.1.Изучить правила подготовки пациента, забора и транспортировки материала для исследования пигментного обмена.

1.2.Освоить методы исследования пигментного обмена и дать их аналитическую оценку.

2. СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ.

2.1.Тестовый контроль исходного уровня знаний.

2.2.Разбор теоретического материала по теме занятия.

2.3.Лабораторная работа: «Определение сыворотке крови содержания билирубина».

3. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ.

3.1. Образование и метаболизм желчных пигментов.

3.2. Общий билирубин в сыворотке. Методы определения.

3.4. Прямой и непрямой билирубин в сыворотке.

3.5. Желчные кислоты в сыворотке.

3.6. Клинико-диагностическое значение исследования показателей пигментного обмена.

4.ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ.

4.1. Определение порфиринов в плазме и эритроцитах.

4.2. Определение копро- и протопорфирина.

5. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.