5.3. Исследование окрашенных препаратов мокроты.

Принцип метода: для исследования морфологии клеточных элементов мокроты используют окраску по Романовскому и Папенгейму. При окраске мокроты этими методами необходимо учитывать ее характер (если много слизи, толстый препарат — окраска более продолжительная). При подозрении на наличие злокачественного новообразования экспозиция окраски сокращается.

Ход исследования:

Исследование включает микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю-Нильсену для выявления микобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых бактерий - КУБ), препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты (стрептококки, стафилококки, диплобациллы Фридлендера, пневмококки и др.). В последнем случае бактериоскопическое исследование имеет ориентировочное значение. Правиль­ность выявления этих бактерий всегда подтверждается посевом.

1.Подготовка мокроты для анализа на КУБ

На исследование направляются три пробы мокроты от каждого пациента. Первую пробу мокроты пациент собирает через 1—2 ч после сна под наблюдением медицинского работника. Вторая проба мокроты со­бирается больным в тот же день через несколько часов после взятия первой пробы. Третья проба — утром следующего дня.

Для исследования необходимо получить достаточное количество мокроты (3—5 мл), содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну.

2.Техника приготовления и окраски препаратов.

Новые предметные стекла для очистки кипятят в 10 г/л растворе соды, после чего их промывают водой, затем слабой соляной кислотой и снова водой. Вымытые стекла хранят в стеклянных банках с притертой пробкой в 96° спирте.

Бактерии чаще обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Результат исследования в большей степени зависит от правильного выбора этих частиц. Гнойные частицы выбирают из 4—6 разных мест, распределяют по предметному стеклу тонким слоем. Мазок можно приготовить и другим способом. Стекло с отобранной мокротой покрывают другим предметным стеклом и, придавливая друг к другу, тщательно растирают, раздвигая стекла в противоположном направлении. Нельзя делать беспорядочные вращательные движения, размазывать материал по всему стеклу. Следует оставлять свободным от материала половину или треть стекла, чтобы было удобно окрашивать его, не пачкая рук.

Если мокрота очень вязкая, небольшой гнойный комочек за­хватывают пинцетом, осторожно отрезают ножницами и наносят его на середину предметного стекла. Пинцет и ножницы обжигают в пламени спиртовой горелки. Подготовленные мазки просушивают на воздухе в течение 15—30 мин. Подогревать препарат для высушивания не рекомендуется, так как при этом легко происходит разрушение микробных клеток. Высушенный мазок фиксируют трехкратным проведением его в течение 3—5 с через среднюю и наиболее яркую часть пламени спиртовки. Нужно из­бегать следующих ошибок:

1) изготовлений слишком толстых препаратов (трудно искать бактерии),

2) фиксирования плохо вы­сушенных мазков (получается плохая окраска),

3) недостаточной фиксации, ведущей к сползанию препарата,

4) длительной фик­сации над пламенем, вызывающей обугливание мокроты, что сильно отражается на качестве окраски.

3.Окраска по Цилю-Нильсену.

Предметные стекла помещают на мостик с промежутками между краями. Мазки накрывают фильтровальной бумагой. На всю по­верхность фильтровальной бумаги, покрывающей стекло, нано­сят карболовый фуксин Циля (1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 50 г/л раствора карболовой кислоты). Стекло с мазком медленно нагревают над пламенем спиртовки до появления пара. Не допускается кипение или высушивание окрашивающего раствора на пред­метном стекле. Если раствора недостаточно, его можно добавить и нагреть второй раз. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 мин, после чего фильтровальную бумагу удаляют пинцетом и помещают в бачок для сбора отходов. Каждое предметное стекло аккуратно ополаскивают отдельно под слабой струей воды из водопроводного крана до полного удаления окрашивающего раствора. Мазок держат ребром к струе воды. Не раз­решается смывать и обесцвечивать одновременно несколько мазков во избежание перекрестного заражения. Все стекла помещают на мостик и обрабатывают, каждый из них индивидуально, 250 г/л раствором серной кислоты до полного отхождения краски. Смывают каждое предметное стекло как описано выше. Затем каждый мазок обрабатывают 96° этиловым спиртом в течение 5 мин и промывают водой. Обесцвеченные, промытые стекла с мазками докрашивают (3 г/л водным раствором метиленового синего в течение 60 с), промывают, как описано выше, оставляют сушить на воздухе.

Клиническое значение

Нейтрофилы составляют основную массу лейкоцитов. Выглядят как округлые клетки с сегментированным ядром и зернистой цитоплазмой. Часто имеют неправильную форму и нечеткое распавшееся на фрагменты ядро. Дегенеративные изменения в нейтрофилах встречаются в основном в гнойной мокроте, при абсцессе, туберкулезе.

Эозинофилы имеют округлую форму, двухсегментное иногда круглое ядро. Цитоплазма с крупной ярко-розовой зернистостью. Иногда при бронхиальной астме, эозинофилы в скоплениях разрушаются и видны в виде массы эозинофильных зерен.

Лимфоциты и базофилы хорошо дифференцируются и имеют все признаки характерные для этих клеток.

Гистиоциты – встречаются в препаратах мокроты постоянно в различных количествах. Могут быть разной величины, округлой или неправильной формы, часто с дистрофическими изменениями. Ядро круглое, овальное, бобовидное или палочковидное, расположено эксцентрично, окрашивается не интенсивно. Цитоплазма вакуолизированная голубая.

Альвеолярные макрофаги – клетки круглой или овальной формы. Ядро имеет округлую, овальную или палочковидную форму и небольшие размеры. Возможно наличие двух и более ядер. Цитоплазма пенистая, голубого или розоватого цвета. При большом количестве включений эти клетки могут окрашиваться в бурый или черный цвет.

Гигантские многоядерные клетки хронического воспаления. Ядра круглые, одинакового размера. С нежным сетчатым рисунком хроматина. Ядра могут быть распределены в клетке равномерно или собраны в центре.

Эпителиоидные клетки. Овальной формы, с ядром самой разной формы (бобовидной, грушевидно, овальной) с нежным мелко-точечным хроматином. Цитоплазма светлая, базофильная с вакуолями. Эти клетки присутствуют в мокроте при туберкулезе и саркоидозе так как, являются элементами туберкулезной гранулемы.

Клетки Пирогова–Лангханса. Гигантские многоядерные клетки, содержащие 20 и более ядер, которые имеют вытянутую форму и располагаются виде частокола по периферии клетки, иногда только на одной ее половине. Цитоплазма широкая, бледно-голубого цвета. Эти клетки также являются элементами туберкулезной гранулемы, но встречаются очень редко так как, легко разрушаются при казеозном распаде. Могут выявляться при вирусном поражении легких.

Плоский эпителий представлен большими, округлыми или полигональными клетками поверхностного и промежуточного слоев. Плоский эпителий полости рта, как правило, покрыт бактериями.

Эпителий бронхов. В зависимости от того, из какого уровня бронхиального дерева происходят эти клетки, они могут иметь призматическую или кубическую форму.

Реснитчатые клетки имеют вытянутую форму с одним широким концом, другим конически суженным. На широкой части клетки находится кутикулярный ободок – утолщенная мембрана клетки, от которой отходят реснички. Ядро круглой или овальной формы, смещено к узкой части клетки. Располагаются реснитчатые клетки разрозненно или пластами, в которых они напоминают соты, имеют круглые ядра окруженные узким ободком цитоплазмы.

Бокаловидные клетки похожи на реснитчатые по размеру и форме, но не имеют ресничек. Цитоплазма вакуолизирована, так как, содержит много секрета, слабобазофильная. Ядро расположено эксцентрично.

Флора.

В нативных препаратах обнаруживается и кокковая и палочковая флора. Пневмококки характерны для хронического очага и распространяются по периферии вместе с воспалительным инфильтратом (экссудатом). Для стафилококковой инфекции характерно мелкоочаговое поражение с тенденцией к слиянию очагов с образованием участков некроза и абсцедирования. При этом микрофлора располагается в центре воспалительного очага, а по периферии - безмикробный инфильтрат.