5.4.Определение физических свойств ликвора

Для получения спинномозговой жидкости производят люмбальную пункцию между остистыми отростками III и IV или IV и V поясничных позвонков. Ликвор должен быть исследован немедленно после его получения, т. к. при стоянии форменные элементы, находящиеся в нем быстро разрушаются (цитолиз).

Цвет

Принцип метода: в пробирку из бесцветного стекла, наливают воду и сравнивают цвет в обеих пробирках, располагая их на уровне глаз, на фоне листа белой бумаги.

В норме, спинно-мозговая жидкость бесцветная. При патологии цвет ликвора может меняться. Розовый или кровянистый цвет может быть обусловлен примесью крови при свежих субарахноидальных кровоизлияниях. Ксантохромия – слаборозовое, оранжевое, бурое или коричневое окрашивание ликвора, появляющееся в результате метаболизма выходящего из эритроцитов гемоглобина. Желтый цвет ликвора обусловлен биливердином и билирубином.

Прозрачность

Принцип метода: в пробирку из бесцветного стекла, наливают воду и сравнивают прозрачность в обеих пробирках, располагая их на уровне глаз, на черном фоне.

В норме спинно-мозговая жидкость прозрачная. Помутнение ликвора может быть обусловлено двумя причинами: увеличением числа клеточных элементов или высоким содержанием бактерий.

5.5.Определение химических свойств ликвора

К предварительным исследованиям белкового состава ликвора относятся осадочные пробы пробы Панди и Нонне-Аппельта. Эти пробы дают приблизительную информацию об уровне белка и соотношении концентрации альбумина и глобулинов в спинно-мозговой жидкости.

Реакция Панди

Принцип метода: в насыщенном растворе карболовой кислоты альбумины и глобулины денатурируют и выпадают в осадок.

Реактив Панди: 10 г кристаллической карболовой кислоты размешивают в 100 мл дистиллированной воды. Далее инкубируют в термостате при 37˚С в течение 12 часов, а затем выдерживают 2 суток при комнатной температуре. Прозрачную жидкость над красным осадком сливают и хранят в посуде из темного стекла.

Ход определения: На стекло на темном фоне капают 1-2 мл реактива Панди и добавляют 1-2 капли ликвора.

Оценка результатов реакции Панди:

Результат	Оценка	Пояснение
Нет помутнения	-	Реакция отрицательная
Опалесценция	±	Реакция сомнительная
Слабое помутнение	+	Реакция слабоположительная
Явное помутнение	++	Реакция положительная
Явное интенсивное помутнение	+++	Реакция резко положительная

Глобулиновая реакция Ноне-Аппельта

Принцип метода: реакция высаливания. При 50% насыщении сульфатом аммония глобулины выпадают в осадок, в то время как альбумины остаются в растворе.

Реактивы: насыщенный раствор сульфата аммония (85 г (NH₄)₂SO₄ растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды). Раствор отфильтровать и остудить до комнатной температуры. После охлаждения на дне образуются кристаллы сульфата аммония. Реактив можно использовать через несколько дней после приготовления. Перед использованием следует проверить рН и при необходимости довести до нейтральной аммиаком.

Ход определения

Смешать равные объемы ликвора и раствора сульфата аммония. Результат читается через 3 минуты.

Оценка результата проводится так же, как и при реакции Панди.

Клиническое значение.

В нормальной спинно-мозговой жидкости после добавления насыщенного раствора сульфата аммония определяется только легкая опалесценция. Положительный результат свидетельствует об увеличении уровня глобулинов.

Количественное определение общего белка

Принцип метода: белки в присутствии сульфосалициловой кислоты и сульфата натрия образуют преципитаты, в результате чего определяется помутнение, которое пропорционально концентрации белка.

Реактивы:

1. Сульфосалициловый реактив (5 г сульфосалициловой кислоты и 16 г водного сульфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Реактив стоек при комнатной температуре.

2. Физиологический раствор хлорида натрия 0,9%

3. матричный раствор глобулина 10 г/л.

Ход исследования:

	Опыт	Контроль
Сульфосалициловый реактив	1,6 мл	-
0,9№ NaCl	-	1,6 мл
Ликвор	0,4 мл	0,4 мл

Пробы выдерживают в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего фотометрируют на ФЭКе. Длина волны 440 нм, кювета с длинной оптического пути 10 мм.

Расчет результатов:

С= Е_оп×К,

где Е_оп - экстинция опыта, К – коэффициент, вычисленный из калибровочной кривой.

Нормальные значения концентрации белка в ликворе, полученном при люмбальной пункции у взрослых: 0,15 – 0,45 г/л.

Клиническое значение.

Повышение концентрации белка в ликворе связанно с нарушением либо проницаемости гематэнцефалического барьера (травма, инфекция), либо обратного всасывания белка из ликвора клетками паутинной оболочки (инфекционные поражения, механический блок оттока ликвора опухолью, абсцессом, спайками), или может быть обусловлено увеличением синтеза иммуноглобулинов лимфоцитами или плазматическими клеткам в ЦНС (рассеянный склероз).

Уменьшение концентрации общего белка в ликворе наблюдается при нарушении целостности твердой мозговой оболочки.

Количественное определение глюкозы

Концентрация глюкозы в ликворе зависит от ее концентрации в крови. Поэтому при измерении концентрации глюкозы в ликворе необходимо параллельно определять ее в крови и ориентироваться на соотношение концентрации глюкозы в ликворе и крови в норме это соотношение около 0,6.

Принцип метода: глюкозооксидаза окисляет глюкозу до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода. Перекись водорода под действием пероксидазы окисляет краситель, который в окисленной форме дает окрашивание. Выраженность окраски пропорциональна количеству окисленного красителя. Ход аналитической процедуры такой же как для определения глюкозы в сыворотке крови

Клиническое значение.

Нормальные значения: 2,75-4,4 ммоль/л (60 % от плазмы крови для взрослых). Наиболее клинически значимым является уменьшение концентрации глюкозы в ликворе. Это связанно с нарушением транспорта глюкозы в ЦНС; увеличением гликолитической активности в ЦНС; увеличением интенсивности утилизации глюкозы лейкоцитами и микроорганизмами, находящимися в ликворе. За счет последнего механизма наблюдается уменьшение концентрации глюкозы в ликворе при бактериальных менингитах (особенно туберкулезных). К уменьшению концентрации глюкозы могут приводить субарахноидальные кровоизлияния, метастатическое поражение оболочек мозга.

При вирусном менингите, энцефалите, абсцессе мозга, сифилисе, опухолях мозга уровень глюкозы в ликворе чаще остается в норме.

У больных сахарным диабетом наблюдается увеличение глюкозы в ликворе на фоне нормального отношения глюкозы ликвора к глюкозе крови. Наличие путевой крови повышает уровень глюкозы в ликворе.

Микроскопическое исследование ликвора

Микроскопическое исследование ликвора складывается из подсчета общего количества клеток в камере Фукса-Розенталя (цитоз) и дифференцировки клеточных элементов (цитограмма ликвора) в окрашенных препаратах.

Подсчет цитоза

Реактив Самсона: 30 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл карболовой кислоты, 2 мл спиртового

Раствора фуксина (1:10) до 100 мл доливают дистиллированной водой. Реактив Самсона стоек, сохраняет лейкоциты без изменения в течении нескольких часов, предотвращая цитолиз. Уксусная кислота лизирует эритроциты. Реактив окрашивает ядра клеток в красный цвет, что облегчает их подсчет.

Ход исследования.

Ликвор отмеривают микропипеткой и смешивают с реактивом в соотношении 10:1 (10 частей ликвора и 1 часть реактива) после чего смесь стоит при комнатной температуре 15-30 минут.

Заполняют камеру Фукса-Розенталя (емкость камеры 3,2мкл). Подсчет клеток производят по всей сетке при малом увеличении микроскопа (окуляр 15х, объектив 8х). Результат выражается количеством клеток в 3 мкл. Чтобы вычислить количество клеток в 1 мкл, следует их количество во все камере поделить на 3.

В нормальном ликворе у взрослых содержится 0-5 клеток в 1 мкл.

Клиническое значение.

Любой процесс, затрагивающий оболочки мозга, может приводить к увеличению количества лейкоцитов в ликворе (плеоцитозу), степень которого будет зависеть от типа патологии, ее продолжительности и интенсивности. Особенно ярко выражен плеоцитоз при тяжелых острых инфекционных менингитах. В то же время, отсутствие плеоцитоза не исключает органическое поражение головного мозга и менингиальных оболочек.

Определение характера цитоза

Принцип метода. Для приготовления препарата при исследовании цитограммы ликвор центрифугируют в специальных центрифугах и готовят препарат из осадка. Окраску препарата проводят обычными методами окраски (по Нохту, Паппенгейму-Крючкову или Романовскому-Гимза).

У взрослых в норме клеточный состав ликвора обусловлен преимущественно лимфоцитами и моноцитами.

Клиническое значение.

При различной патологии, может изменятся как количественный, так и клеточный состав ликвора:

- лимфоциты в норме присутствуют в ликворе. Выраженный лимфоидный плеоцитоз наблюдается при вирусных менингитах, нейросифилисе, рассеянном склерозе, туберкулезном менингите.

- нейтрофильный плеоцитоз характерен для бактериального менингита, абсцессах мозга.

- эозинофилы в нормальном ликворе не встречаются. Эозинофилия наблюдается прицистоциркозе, эхинококкозе мозга. В небольших количествах (2-3%) появляются в ликворе при туберкулезном менингите, внутримозговых кровоизлияниях, при опухолях мозга, лекарственной интоксикации.

- базофилы в нормальном ликворе не встречаются. Базофилия ликвора обнаруживается в ликворе при тяжело протекающих нейроинфекциях, особенно у детей.

- моноциты в норме присутствуют в ликворе. Моноцитоз наблюдается при нейросифилисе, рассеянном склерозе, хронических вялотекущих воспалительных процессах в центральной нервной системе.