5.1. Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю)

Принцип метода: в результате переаминирования, происходящего под действием ACT и АЛТ, образуются щавелевоуксусная и пировиноградная кислоты. Первая в реакционной смеси превращается в пировиноградную кислоту. При добавлении раствора 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останавливается, и образуются гидразоны пировиноградной и, отчасти, щавелевоуксусной кислот. В щелочной среде они дают коричневое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты, а значит, и активности фермента.

Реактивы:

• 0,1 моль/л фосфатный буфер, рН = 7,4. Для его приготовления смешивают 840 мл 0,1 моль/л раствора двузамещенного фосфата натрия NaНРО₄-2Н₂О (17,4 г кристаллической соли растворяют в 1 л дистиллированной воды. Двузамещенный фосфорнокислый натрий, содержащий две молекулы воды, получают путем выветривания на воздухе в течение 2 сут. кристаллической соли, содержащей обычно 12 молекул воды; соль предварительно растирают в ступке в порошок) и 160 мл 0,1 моль/л раствора безводного однозамещенного фосфата калия КН₂РО₄ (13,6 г КН₂РО₄ растворяют в одном литре дистиллированной воды).

• Буферный раствор с индикатором бромтимоловым синим должен давать голубую окраску. В качестве консерванта можно использовать 5—10 мл хлороформа, добавляемых ко всему объему буферного раствора.

• Раствор бромтимолового синего, 0,4 г/л. 100 мг индикатора растворяют в ступке с 3,2 мл 0,05 N раствора едкого натра. Затем смесь смывают водой в мерную колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки.

• Субстратный раствор для определения активности аспартатаминотрансферазы. 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагиновой кислот (либо 1,33 г L-аспарагиновой кислоты) взвешивают на аналитических весах в бюксике и к полученной навеске добавляют раствор 1 N NaОН, приливая его осторожно, небольшими порциями до полного исчезновения осадка и приобретения раствором рН = 7,4 (на что уходит обычно около 20 мл раствора щелочи). Для определения рН раствора используют универсальную индикаторную бумагу или рН-метр. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 100 мл, ополаскивают посуду 0,1 моль/л фосфатным буфером (рН = 7,4) и доводят им объем содержимого колбы до метки. Субстратный раствор тщательно перемешивают, прибавляют к нему 1 каплю хлороформа, сохраняют в холодильнике в замороженном состоянии. Перед употреблением замороженный раствор следует полностью оттаять.

• Субстратный раствор для определения активности аланинаминотрансферазы. 29,2 мг α-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г DL-аланина (либо 0,89 г L-аланина) взвешивают в бюксике на аналитических весах. Дальнейшая процедура приготовления раствора аналогична таковой, описанной для приготовления субстратного раствора для определения активности аспартатаминотрасферазы, только без добавления щелочи.

• Раствор 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ). 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидразина растворяют в небольшом объеме 1 N (или, лучше, 2 N) раствора соляной кислоты при нагревании смеси на водяной бане. После того как раствор остынет, доводят его объем раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

• 1 N раствор NaОН (4 г реактива растворяют в 100 мл дистиллированной воды).

• 0,4 N раствор NаОН. 16 г едкого натра растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. После остывания раствора доводят объем до 1 л.

• Стандартный раствор пировинограднокислого натрия СНзСОСООNа. 22 мг точно взвешенного кристаллического пирувата натрия (белого цвета) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем дистиллированной водой до метки; 1,6 мл раствора содержит 220 мкг пирувата натрия, что соответствует 176 мкг пировиноградной кислоты. Раствор используют для построения калибровочного графика.

Ход определения активности аспартатаминотрансферазы (ACT):

Опытную пробу готовят следующим образом. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора и прогревают смесь при 37 °С в течение 5 мин. Затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и пробирку помещают в термостат для выдерживания при 37 °С в течение 60 мин. После извлечения ее из термостата в содержимое пробирки добавляют 0,5 мл 2,4-ДНФГ, После перемешивания пробы вы­держивают в течение 20 мин при комнатной температуре (для развития реакции). Затем приливают 5 мл 0,4 N раствора NaOH и после повторного тщательного перемешивания раствора пробу оставляют при комнатной температуре на 5—10 мин для развития окраски. Оптическую плотность проб измеряют на ФЭКе при 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольных проб.

Контрольные пробы обрабатывают, как и опытные пробы, однако сыворотку крови в них добавляют после 2,4-ДНФГ.

Ход определения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ:.

В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для исследования активности АЛТ, прогревают 5 мин при 37 °С, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешива­ют и помещают смесь на 1 ч в термостат для инкубации при 37 °С. Дальнейший ход анализа осуществляют так же, как и при определении ACT.

Аминотрансферазную активность сыворотки рассчитывают по калибровочному графику, показывающему зависимость абсорбции от содержания пировиноградной кислоты в пробе. Чтобы получить данные для построения калибровочной кривой, в пробирки наливают ингредиенты в количестве, указанном в таблице, перемешивают их, добавляют по 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ и через 20 мин приливают по 5 мл 0,4 N раствора NaOH. Через 5—10 мин измеряют оптическую плотность проб на ФЭК при зеленом светофильтре (540 нм) в кюветах с шириной слоя 10 мм против контроля и производят расчет по калибровочному графику.

№ пробирок	Физ. р-р, мл	Стандартный р-р пирувата натрия, мл	Субстратный р-р для АСТ или АЛТ, мл	Активность трансаминаз
				Моль/ч л	Мккат/л
1 (контроль)	0,1	-	0,50	-	-
2	0,1	0,05	0,45	1,0	0,28
3	0,1	0,10	0,40	2,0	0,56
4	0,1	0,15	0,35	3,0	0,84
5	0,1	0,20	0,30	4,0	1,12
6	0,1	0,25	0,25	5,0	1,40

На осях ординат и абсцисс графика откладывают соответствующие величины абсорбции и активности фермента. Начиная с величины абсорбции 0,30, градуировочная линия отклоняется от прямой. Поэтому при показателях экстинкции выше 0,30 анализируемые пробы (с большой ферментативной активностью) разводят физиологическим раствором в 5—10 раз. Полученные показатели активности фермента умножают на величину разведе­ния. В сыворотке крови практически здоровых взрослых людей активность аминотрансфераз составляет 0,14—0,28 мккат/л (максимальное значение равно 0,42 мккат/л).