5.1. Определение общего белка в сыворотке (плазме) крови биуретовым методом (Кингслея—Вейксельбаума)

Принцип метода: белки сыворотки (плазмы) крови, реагируя в ще­лочной среде с сернокислой медью, образуют соединения, окра­шенные в фиолетовый цвет. Интенсивность окрашенного комплекса измеряется на фотометре. длине волны 540—560 нм, лучше 546 нм, против контрольной пробы, которую готовят путем добавления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл физиологического раствора хлористого натрия.

Реактивы:

• 0,154 N раствор хлорида натрия (физиологический). 0,9 г NaCl растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

• 0,2 N раствор едкого натра. 20 мл 1 N раствора NaОН доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, освобожденной от углекислого газа путем кипячения.

• Биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой соли (КNaС₄Н₄О₆) растворяют в 40 мл 0,2 N Na0H. После растворения прибавляют 1,5 г СuSО₄-5Н₂О и 0,5 г КI. Раствор доводят до 100 мл 0,2 N NaOH. Его следует хранить в темном месте (или в посуде из темного стекла). Реактив пригоден около месяца.

• Щелочный раствор йодистого калия. 0,5 г КI растворяют в 100 мл 0,2 N NаОН. Хранить в посуде из темного стекла не более двух недель.

• Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл биуретового реактива (3) смешивают с 80 мл раствора КI (4). Хранить в темном месте не более двух недель.

• Стандартный раствор альбумина (из человеческой сыворотки). Готовят путем растворения 1,0 г альбумина (в небольшом цилиндре или точной мерной пробирке) в 6—7 мл физиологического раствора NaСl с последующим доведением им до конечного объема 10 мл. Для полного растворения белка содержимое пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Поскольку пенообразование ускоряет разрушение альбумина, с целью предотвращения этого нежелательного эффекта можно внести одну (или несколько) капель октилового спирта либо медицинского (диэтилового) эфира, понижающих поверхностное натяжение, либо отцентрифугировать 3—5 мин при 1500 об/мин. 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка (100 г/л).

Ход исследования.

К 5 мл рабочего раствора биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 0,1 мл сыворотки крови. Через 30 мин, самое позднее через 1 ч, пробу колориметрируют на ФЭКе в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540—560 нм, лучше 546 нм, против контрольной пробы, которую готовят путем добавления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл физиологического раствора хлористого натрия.

Построение калибровочной кривой. Для построения калиб­ровочного графика из основного стандартного раствора белка готовят 3 серии рабочих стандартных растворов, как указано в таблице (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30—60 мин. замеряют оптическую плотность стандартных и опытных проб против биуретового реактива.

Измерения абсорбции начинают производить с раствора меньшей концентрации. По полученным данным строят калибровочный график и вычисляют фактор пересчета F делением концентрации белка на абсорбцию:

F = C_cт / А_ст .

Фактор пересчета используют для расчета концентрации белка в исследуемой пробе.

Для расчета концентрации белка абсорбцию пробы (А_оп) умножают на фактор пересчета (F), тогда концентрация белка равна:

F А_оп

Норма у взрослых — 65—85 г/л.

Построение калибровочного графика для определения общего белка сыворотки крови.

№	Стандартный раствор белка, мл	Физиологический раствор, мл	Концентрация белка, г/л
1	0,4	0,6	40,0
2	0,5	0,5	50,0
3	0,6	0,4	60,0
4	0,7	0,3	70,0
5	0,8	0,2	80,0
6	0,9	0,1	90,0
7	1,0	-	100,0

Клиническое значение.

Гипопротеинемия (снижение концентрации общего белка менее 65 г/л) может быть связана: 1) с пониженным синтезом белка в организме (недостаточное белковое питание, сужение пищевода, нарушение всасывания при энтеритах, энтероколитах, панкреатитах, циррозы печени, активные гепатиты, дистрофия печени, опухоли и их метастазы в печень); 2) с потерей белка (кровотечения, ожоги, нефротический синдром, гломерулонефрит, сахарный диабет, образование экссудатов, транссудатов, асцит и другие); 3) с повышенным распадом белка (злокачественные новообразования, кахексия, тиреотоксикоз, сепсис, длительные воспалительные заболевания, обширные травмы); 4) с гипергидрата­цией (относительная гипопротеинемия).

Гиперпротеинемия (повышенное содержание общего белка более 87 г/л) встречается реже и наблюдается при миеломной болезни, болезни Вальденстрема, хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях и обезвоживании организма при неукротимой рвоте, профузных поносах, усиленном потоотделении (относительная гиперпротеинемия).