15. Методы выделения и очистки белков.

Методы выделения и очистки белков. 1 .гомогенизация - клетки растираются до однородной массы; метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком. 2.экстракция белков водными или водно-солевыми растворами; 3 .диализ;

Методы разделения белков: Высаливание – основано на различиях раст-мости белков при разной концентрации солей. Соли щелочных и щелочно-земельных металлов вызывают обратимую денатурацию белков (осаждение), т.е. после удаления соли белки снова р-тся сохр-ая свои нативные св-ва.

Электрофорез – основан на движении + заряж-ых мол-л к катоду, - к аноду. Проводят на различных носителях, бумаге, крахмалном геле.

Ультрацентрифугирование – основано на различии в мол-ой массе белка. Разделение под действием центробежной силы, в р-те белки делятся на фракции различной мол-ой массой.

Хроматографические: а) ионообменная хроматография - основана на различной способности отдельных белков к обмену с ионами ионообменных смол; б) на молекулярных ситах (гель-фильтрация) - на сефадексах - белки разделяются в зависимости от величины молекулы; в) аффинная хроматография белки делятся на индивидуальные в зависимости от средства к аффинату (наполнителю колонок).

Аминокислотный состав белков и пептидов после гидролиза опр-ют в аминокислотном анализаторе.

Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани.

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

16.Некоторые природные пептиды и белки (окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон, инсулин, гастрин, глюкагон, глютатион и др.), их биологические функции. ОКСИТОЦИН, пептидный гормон млекопитающих; кристаллич. в-во; хорошо раств. в воде; рI 7,7. Окситоцин образуется в передних ядрах гипоталамуса, хранится в заднем гипофизе. Выделение окситоцина стимулируют растяжение матки на поздних сроках беременности, а также раздражение соска при лактации. Осн. физиол. действие окситоцина-стимуляция гладких мышечных волокон молочных желез и матки. Биол. эффект осуществляется посредством взаимод. молекул окситоцина с рецепторами цитоплазматич. мембран органов-мишеней и активации в них фермента аденилатциклазы, катализирующей образование циклич. аденозинмонофосфата (цАМФ), внутриклеточный эффект к-рого опосредован через цАМФ-зависимую протеинкиназу. За связывание окситоцина с рецепторами клеток ответственна кольцевая часть молекулы и прежде всего остаток Ilе. Противодействует влиянию окситоцина на мышцы матки прогестерон, подавляет секрецию окситоцина адреналин.

ВАЗОПРЕССИН пептидный гормон гипофиза. Вазопрессин близок по хим. строению окситоцину. Вазопрессин усиливает реабсорбцию воды в почечных канальцах, уменьшая мочеотделение и повышая осмотич. концентрацию мочи (антидиуретич. д-ие). Ключевая стадия в механизме действия вазопрессина - активация фермента аденилатциклазы и образование под ее влиянием циклич. 3',5'-аденозинмонофосфата. Вазопрессин вырабатывается нейросекреторными клетками супраоптич. ядра гипоталамуса, по аксонам этих клеток достигает задней доли гипофиза, откуда под влиянием соответствующих стимулов поступает в кровь. Недостаточность вазопрессина в организме обусловливает развитие несахарного диабета (поэтому вазопрессин применяется для его лечения).

АДРЕНОКОРТИКОТРОПИН пептидный гормон гипофиза. Осн. физиол. ф-ция - стимуляция биосинтеза и секреции стероидных гормонов корой надпочечников. Механизм действия включает специфич. связывание адренокортикотропина с рецепторами плазматич. мембраны клеток, стимуляцию в плазматич. мембране фермента аденилатциклазы, осуществляющей превращение АТФ в циклич. аденозинмонофосфат. Последний активирует в цитоплазме протеинкиназу, катализирующую серию р-ций фосфорилирования, в результате чего резко увеличивается скорость образования кортикостероидов, а также синтез специфич. белка, необходимого для стимуляции лимитирующей стадии синтеза стероидов - превращения холестерина в прегненолон. Адренокортикотропин обладает также меланоцитостимулирующей активностью. Кроме того, адренокортикотропин активирует липазу жировой ткани и повышает выход своб. жирных к-т из жировых депо в кровь. Адренокортикотропин вырабатывается специализиров. клетками передней доли гипофиза. Секреция адренокортикотропина регулируется гипоталамусом, в к-ром вырабатывается пептид кортиколиберин, стимулирующий выделение адренокортикотропина в кровь.

ИНСУЛИН, белковый гормон, вырабатываемый поджелудочной железой и регулирующий уровень сахара (глюкозы) в крови; препараты инсулина применяются для лечения сахарного диабета. Гормон синтезируется в бета-клетках, которые входят в отдельные гормон-секретирующие группы клеток поджелудочной железы, называемые островками Лангерганса. Молекула инсулина состоит из двух аминокислотных цепей. Цепи соединены друг с другом двумя дисульфидными мостиками (т.е. каждый образован двумя атомами серы), а третий дисульфидный мостик связывает отдаленные друг от друга аминокислоты А-цепи. Соединенные цепи частично изгибаются и сворачиваются в глобулярную структуру, и такая конфигурация молекулы гормона важна для проявления его биологической активности. Инсулин – важнейший регулятор промежуточного обмена веществ. Главное его действие заключается в снижении уровня сахара в крови: он облегчает поглощение и использование глюкозы мышечными и жировыми клетками и тормозит образование новых молекул глюкозы в печени. Кроме того, он способствует запасанию глюкозы в клетках в форме гликогена, а также накоплению других веществ – потенциальных источников энергии (жира, белка), тормозит их распад и утилизацию организмом.

ГАСТРИН, пептидный гормон желудочно-кишечного тракта.Обладает сильными кислотными св-вами из-за наличия в молекуле пяти остатков Glu. Основная физиол. ф-ция гастрина-стимуляция секреции к-ты в желудке. Гастрин вырабатывается специализиров. клетками, рассеянными по слизистой оболочке почти всего пищеварит. тракта. В наиб. кол-ве эти клетки локализуются в антральном отделе желудка. В организме вначале синтезируется высокомол. белок-предшественник-прогастрин. Освобождение гастрина происходит под влиянием парасимпатич. нервной системы и разл. компонентов пищи. ГЛЮКАГОН, пептидный гормон поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Глюкагон обладает слабыми основными св-вами (изоэлектрич. точка 7,5-8,5), ограниченно раств. в воде и весьма стоек в водных р-рах при рН 3-9. Осн. ф-ция глюкагона -стимуляция расщепления гликогена в печени, в результате чего происходит повышение концентрации глюкозы в крови. Глюкагон стимулирует также липолиз жировой ткани и выработку инсулина поджелудочной железой и сокращение сердечной мышцы. По своему действию глюкагон-антагонист инсулина. Вырабатывается глюкагон специализиров. клетками поджелудочной железы (т. наз. клетками островков Лангерганса) и слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки.

ГЛУТАТИОН бесцв. кристаллы; т. пл. 190°С (с разл.); раств. в воде, не раств. в этаноле и эфире. При кипячении в воде образует пирролидонкарбоновую к-ту и цистеинилглицин, при взаимод. с нитррпруссидом натрия в щелочной среде дает красную окраску. Под действием мягких окислителей (напр., иода) легко окисляется в дисульфид, что используют для количеств. определения. Специфич. метод определения глутатиона основан на его способности активировать превращ. метилглиоксаля в молочную к-ту под действием фермента глиоксалазы. Биол. ф-ции глутатиона: защищает SH-группы ферментов и др. белков от окисления; восстанавливает Н2О2 и др. пероксиды; связывает своб. радикалы; участвует в тиол-дисульфидном обмене и в обезвреживании мн. чужеродных для организма соед.; восстанавливает рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды; переносит аминокислоты через мембрану клеток; является кофактором ряда ферментов, напр. глиоксалазы и формальдегиддегидрогеназы.