287. Виды и роль тандемных повторов в геноме человека.

Тандемные повторы — последовательности повторяющихся фрагментов ДНК. В зависимости от размера подразделяются на три класса: сателлитная ДНК,минисателлиты и микросателлиты.

Сателлиты. Длина последовательности высокоповторяющихся сателлитов составляет от 100 тысяч до более чем 1 миллиона нуклеотидов. Повторяющаяся последовательность, как правило, составляет более 100 пар оснований. Сателлитная человека расположена в центромерах всех хромосом. Длина одного повтора составляет 171 пару оснований, а весь повторяющийся регион занимает около 3—5 % размеров каждой хромосомы. Другие сателлиты имеют меньшую длину повтора. Большая часть сателлитов как человека, так и остальных организмов локализованы в центромере.

Минисателлиты. Минисателлиты — повторяющиеся фрагменты ДНК длиной от 7 до 100 нуклеотидов. Они встречаются более чем в 1000 местах генома человека. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, в популяционно-генетических исследованиях при определении принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации, в ДНК-дактилоскопии. Один из видов минисателлитов — гипервариабельные минисателлиты , расположены в некодирующих регионах ДНК и также широко используются в популяционных исследованиях, так как не подвержены влиянию естественного отбора.Теломеры человека и других млекопитающих содержат тандемные повторы GGGTTA.

Микросателлиты. Микросателлиты — повторяющиеся фрагменты ДНК длиной от 1 до 6 пар оснований. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Как и минисателлиты, используются как молекулярные маркеры в популяционно-генетических исследованиях.

Тандемные повторы играют важнейшую роль в самом существовании хромосом. Любая хромосома должна быть отграничена от остального генетического материала (это обеспечивается уникальными свойствами теломерной ДНК) и должна нормально наследоваться, правильно «растаскиваться», при делении клетки (центромерная ДНК). Без клонированных теломерных и центромерных участков невозможно и создание искусственных хромосом, необходимых для манипуляций с генами.

288. Перечислите базовые регуляторные элементы генома.

Энхансеры- небольшой участок ДНК, способный связываться с факторами транскрипции, при этом увеличивая уровень транскрипции гена или группы генов.

Сайленсеры- последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полному подавлению синтеза РНК ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

Инсуляторы-последовательности ДНК, особые регуляторные элементы, которые обладают способностью блокировать сигналы, исходящие от окружения. Они блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. Инсулятор выполняет барьерную функцию для распространяющегося конденсированного хроматина.

289. Методы клонирования днк.

Рестрикция — лигирование .

В классических методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование ДНК с вектором, трансфекция и последующий скрининг (отбор).

Выделение вставки.

Первоначально необходимо выделить участок ДНК для клонирования. Выделение вставки может быть сделано технологией клонирования шотган, комплементарной ДНК, искусственным химическим синтезом.

Трансформация.

После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии далее выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки.

Отбор.

Получают культуры трансфецированных клеток.

Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры (как правило, гены устойчивости к антибиотикам) которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой расти на селективной среде (с антибиотиком).

Генная терапия.

Генная терапия подразумевает введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена.