268. Принцип метода секвенирования днк.

. Секвенирование ДНК - определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности ДНК. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов

При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распределяют по четырём пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырёх 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырёх пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

269. Структура генома.

Геном клетки человека состоит из следующих участков:

1. Уникальных генов (Это гены представленные в геноме в одном экземпляре. К таким генам относятся некоторые структурные и регуляторные гены.).

2. Семейств генов (Набор генов, возникший от некоего гена-предка путем дупликации и последующих изменений. В семейство могут входить три типа генов: 1)функционирующий ген или его копии, 2)нефункционирующие копии – псевдогены и 3)функционирующие мутантные гены.

3.Регуляторных зон (Эти зоны ДНК постоянно присутствуют в геноме человека. К ним относятся терминатор, трейлерные и лидирующие последовательности нуклеотидов, промотор, модуляторы и т.д. Все эти участки регулируют транскрипцию и другие генетические процессы.)

4. Повторяющихся участков ДНК, которые несут какую-либо функцию, т.е. участвуют в каких-любо генетических процессах (транскрипции, тансляции, репликации, репарации, процессинге и т.д.).

5. Повторяющихся участков ДНК, у которых в настоящее время достоверно не выявлено какой-либо функции. Однако предполагают, что эти участки могут участвовать в процессах упаковки ДНК .

6. Транспозонов (сегменты ДНК обладающие способностью перемещаться в другие геномные локусы, иногда существенно изменяя экспрессию соседних генов.) .

270) Комплементарная, клонированная, рекомбинантная днк.

Клонирование ДНК.

-Ферменты рестриктаз, способных разрезать двойную спираль ДНК по специфической последовательности из 4-8 нуклеоти на фрагменты строго определённого размера, вызывают ступенчатые разрывы, в результате чего на концах фрагментов ДНК образуются короткие одноцепочечные «липкие хвосты», которые могут комплиментарно связываться с подобными «липкими хвостами», образовавшимися под действием того же фермента. Благодоря «липким хвостам» можно присоединить фрагмент ДНК, содержащий гены человека, к ДНК вируса. Если полученную рекомбинантную молекулу ДНК ввести в бактериальную клетку, то за счёт репликационной активности вируса за короткое время можно получить (клонировать) миллионы молекул вирусной ДНК, содержащей гены человека. Методы клонирования позволяют получать интересующую ДНК в достаточном количестве для последующего анализа.

Комплементарная ДНК — это ДНК, синтезированная на матрице зрелой мРНК в реакции, катализируемой РНК-зависимой ДНК-полимеразой.

-В процессе синтеза белка ДНК транскрибируется в мРНК, и мРНК далее транслируется в белки. Одним из различий между прокариотами и эукариотами является то, что гены эукариот могут содержать интроны — некодирующие последовательности, которые вырезаются из незрелой мРНК в процессе сплайсинга. Гены прокариот не имеют интронов, поэтому прокариотические мРНК не подвергаются сплайсингу.

Рекомбинантная ДНК — искусственно созданная последовательность ДНК, части которой могут быть синтезированы химическим путём, с помощью полимеразной цепной реакции или клонированы из ДНК различных организмов.

-Рекомбинантные ДНК могут быть трансформированы в клетки живых организмов в составе плазмид или вирусных векторов.