223. Международная Парижская классификация хромосом человека
Парижская классификация. В1971 году в Париже на IV международном конгрессе по генетике человека была согласована единая система идентификации хромосом человека, учитывавшая дифференцировку хромосом по длине. Каждая хромосома набора человека при дифференциальной окраске характеризуется уникальным для нее сочетанием темно окрашенных сегментов или полос , чередующихся с неокрашенными участками или светлыми сегментами. Именно такое специфическое для данной хромосомы сочетание сегментов позволяет четко ее идентифицировать и отличить от других хромосом набора.
В пределах короткого (р) и длинного (q) плеча каждой хромосомы выделяют ряд четко идентифицируемых областей или регионов, которые нумеруются арабскими цифрами начиная от центромеры к теломерному участку или терминальному концу хромосомы. Каждая область хромосомы включает определенное числосегментов, нумерация которых (второй арабской цифрой) также идет в направлении от центромерного к теломерному участку. Таким образом, обозначение хромосомного сегмента 2q34 означает хромосому №2, длинное плечо, 3 регион и 4 сегмент. Сама центромера обозначается сочетанием цифр 1 и 0, т.е. часть центромеры в пределах короткого плеча обозначается как- р10, а часть, включающая длинное плечо -q10. Открытие в середине 70-х годов того факта, что профазные и про-метафазные хромосомы позволяют достичь большего числа сегментов, чем метафазные хромосомы, и, следовательно, повысить разрешающие возможности цитогенетического исследования, привело к разработке методов получения хромосом высокого разрешения и потребовало дополнения цитогенетической номенклатуры новыми принципами анализа таких хромосом. В1980 году по этому поводу в Париже было достигнуто международное соглашение, которое было опубликовано в 1981 году под названием "Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека - сегментация хромосом высокого разрешения" или ISCN (1981). Так, если сегмент в пределах какой-либо хромосомы подразделяется на отдельные субсегменты, то после номера сегмента ставится точка, после которой указывается номер субсегмента. Например, если оригинальный сегмент 1 р31 подразделяется на 3 разных субсегмента, то они обозначаются как 1р31.1, 1р31.2и 1р31.3, причем субсегмент 1р31.1 является проксимальным, а 1 р31.3 - дистальным по отношению к центромере. Дополнительное деление субсегментов на другие сегменты, например субсегмента 1 р31.1, соответственно обозначается как 1p31.11,1р31.12 ит.д.
224. Короткие тандемные повторы. Их роль в днк-диагностике
Результатом определения нуклеотидной последовательности человека стало картирование и описание всех основных геномных элементов: гены, псевдогены, повторы, транспозоны, ретротранспозоны.
Наряду с псевдогенами часто встречающимся элементом в геноме человека являются повторы. Насчитывается их около 5 миллионов, и покрывают собой почти половину генома. Повторы делятся на 2 основных класса: тандемные и диспергированные.
Тандемные повторы представляют собой повторяющиеся последовательности ДНК различной длины: микросателлиты содержат ДНК повторы от 1 до 6 нуклеотидов, минисателлиты от 7 до 100 нуклеотидов, сателлиты более 100 нуклеотидов.
Тандемные повторы или STR используются в КОСВЕННОЙ ДНК-ДИАГНОСТИКЕ (. Косвенные методы молекулярной диагностики пригодны для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мутации неизвестны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких минисателлитных тандемных повторов, типа STR (short tandem repeats), находящихся в непосредственной близости от мутантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству.
*Секвенирование
Для установления точной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК на практике наиболее широкое распространение получил метод секвенирования. Секвенирование (от лат. Sequentum — последовательность) — комплекс методов направленных на расшифровку аминокислотной или нуклеотидной последовательности биополимеров (белков и нуклеиновых кислот). Секвенирование ДНК — прочтение нуклеотидной последовательности первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты.
В основе реакции секвенирования лежит в принцип удлинения новосинтезированной цепи ДНК на изучаемой матрице (фрагмент ДНК, например, продукт ПЦР) при участии праймера, набора дезоксирибонуклеотид-трифосфатовиДНК-полимеразы.Помимо
природных трифосфатов в реакцию также добавляется один из 4 химически измененных дезоксирибонуклеотид-трифосфатов(терминаторов). В качестве таких терминаторов выступаютди-дезоксирибонуклеотид-трифосфаты(ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP). Терминаторные буквы участвуют в реакциях секвенирования раздельно друг от друга при более низкой концентрации относительно их природных аналогов, таким образом, что в результате прохождения реакции они могут случайно встраиваться в растущую цепь обрывая её рост в различных местах по всей длине матрицы. При проведении четырех одинаковых реакции с разнымиди-дезоксирибонуклеотид-трифосфатамив каждой из пробирок накапливается набор дочерних молекул ДНК различной длины, оканчивающихся строго на один и тот же нуклеотид. После электрофореза продуктов этих реакций в 4 соседних дорожках проводится считывание информации от более коротких фрагментов к более длинным, при этом выявляемый пошаговый порядок удлинения цепей
иотражает последовательность нуклеотидов в составе анализируемойДНК-матрицы.При секвенировании геномной ДНК всегда следует помнить, что получаемая картина отражает нуклеотидную последовательность обоих аллелей изучаемого фрагмента гена. Поэтому в случае гетерозиготной мутации (например, нуклеотидной замены) в определенном месте авторадиограммы будут одновременно видны две полосы, соответствующие нормальному и мутантному основаниям. В случае гомозиготной мутации, а также в редких случаях секвенирования «однокопийной» ДНК (например, клонированной ДНК или фрагмента гена сХ-хромосомыу индивида мужского пола) мутация будет определяться как одна полоса, расположенная в атипичном сайте по отношению к нормальному сиквенсу.
Одномоментно может быть секвенирован участок ДНК средней длинной около 500 п.о., поэтому для исследования более длинных участков гена они должны быть амплифицированы в виде совокупности коротких перекрывающихся фрагментов, каждый из которых секвенируется отдельно. Обычно для обнаружения мутаций секвенируются только экзоны изучаемого гена вместе с примыкающими к ним интронными последовательностями (областями сплайсинга). Иногда при небольшом размере гена проводится секвенирование целой молекулы кДНК, получаемой при проведении обратнотранскриптазной ПЦР.
В настоящее время техника секвенирования ДНК значительно усовершенствовалась благодаря внедрению в практику лазерно-флюоресцентныхавтоматических секвенаторов
– специальных приборов, осуществляющих детекцию продуктов реакции в геле путем регистрации интенсивности их флюоресценции. Для этого реакция секвенирования проводится с использованием флуоресцентно-меченныхди-дезоксирибонуклеотид-трифосфатов. При дальнейшем проведении капиллярногогель-электрофореза,флуоресцентно-меченныемолекулы ДНК возбуждаются лазерным лучом и испускают сигнал определенной длиной волны, который фиксируется специальными датчиками и визуализируется на экране в виде разноцветных пиков. Для автоматического считывания
ианализа продуктов реакции используется соответствующее компьютерное программное обеспечение.
**К сведению: (Диспергированные повторы включают в себя транспозоны и ретротранспозоны. Транспозоны – это мобильные элементы, репликация которых включает перемещение своей ДНК последовательности на новое место в геноме. В геноме человека они занимают 2-3%,такие как MER1, MER2. Ретротранспозоны – это мобильные элементы, которые могут самовоспроизводиться в геноме, осуществляя реакцию обратной транскрипции. В геноме человека они занимают 42%, среди них такие семейства как Alu, MIR, LINE1, LINE2. )