214.Методы и условия применения прямой днк-диагностики.

Прямая ДНК – диагностика предполагает непосредственное выявление мутации (измененной нуклеотидной последовательности в исследуемом гене), являющейся непосредственной причиной заболевания. Оно облает абсолютной точностью и требует для анализа только образец ДНК обследуемого лица. Для проведения прямой ДНК – диагностики необходимо точно знать структуру гена или конкретного участка гена, содержащего анализируемую мутацию. Исходным материалом для проведения ДНК-диагностики заболеваний, обусловленных мутациями ядерных генов, могут служить любые клетки организма, содержащие ядро. Обычно для этих целей используются кровь обследуемого. В некоторых случаях более адекватным источником ДНК являются биоптаты мышц.

Методические подходы, используемые при прямой ДНК-диагностике того или иного наследственного заболевания, зависят от характера мутаций и молекулярной организации соответствующего гена. Характер изменений нуклеотидного состава гена может быть различным. Наиболее распространенными являются нуклеотидные замены, ведущие к нарушению аминокислотного состава белка.

215. Методы прямой днк-диагностики.

С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %. Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях:  1) известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания,  2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность. Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы). Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей.Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др

216.Принцип метода блоттинга по Саузерну. Применение в биологии и медицине.

В основе метода Саузерн-блоттинга лежит принципиальная возможность переноса электрофретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного (полиакриламидного)геля на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизации нуклеотидов искомой ДНК с олигонуклеотидным ДНК-зондом.Сформировавшийся комплекс позволяет ответить на вопрос:присутствует или нет в исследуемом образце искомый участок молекулы ДНК.В настоящее время метод блота по Саузерну применяется как в эксперименте,так и в лабораторной диагностике:

• Скрининг клеток на присутствие рекомбинантных(клонированных) вставок

• Выявление трансгенных растений и животных

• Выявление маркерных генов опухолевых клеток

• Выявление различных хромосомных перестроек,точечных генных мутаций

• Выявление вирусной ДНК в исследуемом образце(кровь,слюна,спинномозговая жидкость и др)

• Перинатальная и постнатальная диагностика наследственных заболеваний человека.