Тема 21. Современные методы молекулярной биологии

Основными инструментами в работе молекулярного биолога с нуклеиновыми кислотами являются ферменты. Используют рестриктазы(эндонуклеазы, которые узнают специфические последовательности в ДНК и разрезают молекулу ДНК в этом месте),ДНК-полимеразы,ДНК-лигазы,экзонуклеазыи др.

В настоящее время в основе большинства методов ДНК-диагностики лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Она позволяет быстро получить большое количество копий молекул ДНК (или их фрагментов), достаточное для их дальнейшего анализа (рис. 21.1).

Этапы проведения:

1. нагревание до 90 С (денатурация ДНК).

2. добавление праймера и охлаждение до 55 С (присоединение или «отжиг» праймера).

3. добавление нуклеотидов (субстратов для синтеза) и ДНК-полимеразы, которая проводит удвоение ДНК; затем цикл повторяется.

Метод широко используется для диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, хламидиоз, цитомегаловирусная инфекция, СПИД и др.). ПЦР позволяет обнаружить возбудителя в биологическом материале даже тогда, когда другие методы оказываются неэффективны. Второе направление использования метода ПЦР — генетическое тестирование (обнаружение мутаций в генах и диагностика наследственной патологии).

Клонирование — способ получения большой популяции идентичных молекул, клеток, организмов — потомков одного предка.

Проводятся эксперименты по клонированию стволовых клеток человека и их использованию в стоматологической практике (заместительная клеточная терапия).

Для клонирования отдельных генов используются технологии рекомбинантных ДНК: нужный ген на специальном носителе вводят в бактериальную клетку. В процессе размножения бактерий получают огромное число копий гена.

Вектор — носитель (плазмида или бактериофаг), в который может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования.

Плазмида — небольшая кольцевидная двухцепочечная ДНК, которая реплицируется независимо от ДНК хозяина.

Принципиальный подход к клонированию генов: в плазмиде создают дефект (разрез) с помощью рестриктазы. С помощью этой же рестриктазы вырезают участок ДНК с нужным геном. Благодаря «липким концам» происходит включение чужеродной ДНК в вектор, ДНК-лигаза восстанавливает целостность плазмиды и образованная гибридная молекула помещается в бактериальную клетку (рис. 21.2).

Рис. 21.2. Генная инженерия. Получение рекомбинантной ДНК

Экспрессия гена, закодированного в чужеродной ДНК, приводит к образованию бактериями нужного белка, его можно выделить и использовать. Технологии рекомбинантных ДНК позволяют получать для медицинской практики вакцины, инсулин, соматотропный гормон, интерфероны, эритропоэтин, белки эмали и др.

Тема 22. Гормоны. Общий механизм действия гормонов

Гормоны — это класс регуляторных молекул, синтезируемых специальными клетками.

Особенности биологического действия:

1) низкая концентрация в крови (10^–6–10^–12 М);

2) обязательная связь с рецептором — (R), включающим каскадный механизм усиления гормонального сигнала;

3) изменение скорости синтеза ферментов или их активности;

4) регуляция секреции по принципу прямой и (или) обратной связи.

Взаимодействие гормона и рецептора характеризуется высокой специфичностью, которая обеспечивается комплементарностью между структурой гормона и активного центра рецептора. В результате эффекта кооперативности, возникающего при взаимодействии гормона и рецептора, существенно изменяется активность последнего — это есть феномен амплификации (усиления) гормонального сигнала. Механизм амплификации включает участие специальных ферментов и молекул — вторичных посредников. Гормональный сигнал способен «выключаться» в результате инактивирования рецептора путём фосфорилирования, либо удаления его с поверхности клетки (эндоцитоз) и т. д. Множество разных сигналов, воспринимаемых клеткой, суммируется в один определённый ответ.

Клеточные рецепторы в зависимости от их локализации делятся на 2 большие группы: 1) плазматической мембраны; 2) внутриклеточные.

Рецепторы плазматической мембраны клеток обеспечивают узнавание, связывание и передачу регуляторного сигнала внутрь клетки. Среди них различают:

1. 7-ТМС-(R) — это ин­тегральные мембранные белки с семью трансмембран­ными спиральными сегментами, соединенными гидрофильными внеклеточными и внутриклеточными петлями. Внутриклеточные петли содержат центры связы­вания G-белка.

2. 1-TMС-(R) — это интегральные мембранные белки с одним трансмембранным сегментом и глобулярными доменами на вне- и внутриклеточной поверхностях мембраны. Внеклеточный домен содержит участок узнавания и связы­вания гормона, а внутриклеточный обладает каталитической ак­тивностью. Когда он активируется гормоном, его внутриклеточный домен катализирует образование внутриклеточных вторичных посредников.

3. Каналообразующие рецепторы — состоят из белковых субъединиц, каждая из которых содержит несколько трансмембранных сегментов.

Внутриклеточные рецепторы расположены в цитозоле или ядре клетки. После связывания с гормоном они изменяют скорость транскрипции и трансляции определённых генов.

По химической природе гормоны делят на:

1. пептиды (глюкагон, кортикотропин) и белки (сложные белки — тиреотропин, гонадотропины; простые белки — соматотропин, инсулин);

2. производные аминокислот (адреналин, серотонин, тироксин);

3. стероиды (альдостерон, кортизол, половые гормоны, витамин Д₃) и ретиноевая кислота;

4. производные липидов (эйкозаноиды).