Биохимический метод

Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем (либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой этим ферментом). Биохимические методы позволяют выявить генные мутации, которые являются причиной заболевания обмена веществ (например, фенилкетонурия). Фенилкетонурия наследуется по аутосомно-рецессивному типу больные являются рецессивными гомозиготами (аа). Ген (картирован 12q22-q24), мутации которого приводят к заболеванию, кодирует фермент фенилаланин-гидроксилазу, катализирующей превращение фенилаланина в тирозин. В результате у больного происходит накопление фенилаланина, который превращается фенилпировиноградную кислоту, которая в больших концентрациях является нейротропным ядом.

С помощью нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например фенилкетонурии. Исследуемому вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному аллелю (генотип АА), то концентрация фенилаланина быстро возвращается в контрольному значению, а если гетерозиготен (генотип Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет вдвое медленнее. Аналогично проводят тесты, выявляющие предрасположенность к гипертонии, сахарному диабету и т.д.

Молекулярно-генетический метод

В основе всех молекулярно-генетических методов лежит изучение структуры ДНК.

Этапы анализа ДНК:

1. Выделение ДНК из клеток, содержащих ядра (крови, тканей, спермы, костей, волос и др. биологических материалов), включая трупный материал и ископаемые останки;

2. Обнаружение и размножение (копирование) небольшого интересующего фрагмента из тотальной ДНК методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР);

3. Анализ последовательности нуклеотидов интересующего фрагмента ДНК: регистрация результатов ПЦР обычно с помощью электрофореза.

Полимеразная цепная реакция синтеза днк

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации (размножения) ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выявить и размножить интересующий фрагмент ДНК размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (пн).

Исходные компоненты ПЦР:

1. ДНК-матрица (тотальная ДНК);

2. праймеры (однонитевые синтетические фрагменты ДНК размером 20 – 30 нуклеотидов), строго комплементарные правой и левой границам интересующего фрагмента ДНК).

3. нуклеотиды, являющиеся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

4. фермент – ДНК-полимераза, катализирующий удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидов к растущей цепи синтезируемой ДНК.

ПЦР-анализ включает 30 циклов амплификации. Каждый цикл состоит из трех стадий:

1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, разрыв водородных связей между комплементарными нуклеотидами). Проходит при температуре 93 – 95^оС в течение 1 мин.

2. Отжиг (присоединение) праймеров (50-60^оС, 1 мин).

3. Синтез ДНК – достраивание одноцепочечных участков ДНК по принципу комплементарности (72^оС, 1 мин).

К концу ПЦР происходит накопление нужного участка ДНК до 2ⁿ фрагментов, где n – число циклов амплификации. Этого количества достаточно для точной детекции этого фрагмента методом электрофореза.

7. 4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя.

Практическая работа № 1

Применение закона Харди-Вайнберга для расчета частот генотипов, аллелей и характеристики генетической структуры популяции (группы), используя тест на праворукость и леворукость

Изучение распределения профилей моторной ассиметрии у студентов в группе

Цель работы: определение частоты аллелей праворукости и леворукости.

Выполнение работы: Студенты проводят тестирование по моторным пробам, результаты записывают в виде таблицы. Анализ результатов позволяет оценить профиль моторной ассиметрии студента, а также определить количество студентов, преимущественно владеющих правой рукой (правши), левой (левши) и число амбидекстеров (одинаково успешно владеющих обеими руками).

Серию тестов проводить без пауз. Между сериями желательно делать проводить не менее 5 минут. Внутри серии порядок тестов должен быть разным. Например, в первой серии предлагается: похлопать в ладоши, скрестить пальцы рук и принять позу «Наполеона». После этого студенты должны отметить, какая рука была ведущей в выполненных тестах. Делается пятиминутный перерыв и в другом порядке предлагается следующая серия, например, поза «Наполеона», хлопанье в ладоши, скрещивание пальцев и т.д. (всего пять серий проб). Итог оценивается большинством случаев.

Примечание:

• в позе «Наполеона» ведущей считается рука, кисть которой оказывается сверху;

• бывают случаи, когда кисти оказываются или обе сверху или обе снизу – это амбидекстры;

• при скрещивании пальцев рук ведущая считается та рука, большой палец которой оказался сверху;

• хлопанье в ладоши; ведущей считается рука, оказывающаяся сверху при хлопанье.

Если нельзя выделить ведущую руку, то это амбидекстры.

Вычислите частоту встречаемости рецессивного и доминантного аллелей.

Правши – гомозиготы доминантные (АА); левши – гомозиготы рецессивные (аа); амбидекстры  гетерозиготы (Аа).

• Используя тесты на праворукость и леворукость, составляем таблицу и определяем свой генотип (табл. 1.1).

Таблица 1.1

Порядковый номер теста	Наименование теста			Результаты 3-х кратного повторения каждого теста
	«Аплодисменты»	«Поза Наполеона»	«Скрещенные пальцы»	Пр. рука	Лев. рука
1	правая	левая	лев	1	2
2	правая	левая	лев	1	2
3	правая	левая	лев	1	2
Сумма				3	6

• Проводим анализ результатов тестирования. Помня, что праворукость является доминантным признаком, определяем генотип каждого индивида.

Гомозиготный генотип устанавливается в случае преобладания одной из рук более, чем в 2 раза: при соотношениях (пр.рука) : (лев.рука) равных 7 : 2; 8 : 1; 9 : 0, устанавливается генотип «АА», при обратных соотношениях, т.е. 2 : 7; 1 : 8; 0 : 9 устанавливается генотип «аа». В остальных случаях устанавливается гетерозиготный генотип «Аа».

Полученное в нашем примере соотношение равно 3 : 6, следовательно, у данного индивида гетерозиготный генотип «Аа».

• Составляем суммарную таблицу генотипов всех студентов группы (табл. 1.2):

Таблица 1.2