6 курс / Судебная медицина / Актуальные_вопросы_судебно_медицинской_экспертизы_трупа_В_Клевно

дифференцируют дополнительно по одной или более изосерологическим системам из трех других доступных для диагностики в пятнах: MNSs, P, Hp. Нередко к этой, более сложной работе эксперты подходят формально, не уделяя должного внимания предварительному подбору условий опыта, из-за высокой нагрузки и необходимости сокращать сроки выполнения экспертиз.

Иные (кроме названных) системы крови в последние годы в пятнах вообще не изучают по причине отсутствия или неудовлетворительного качества диагностических реагентов. Дифференцирование следов выделений проводят только в пределах системы АВО, в ряде случаев - с дополнительной маркировкой по категории выделительства.

Правила проведения биологических экспертиз не предусматривают обязательного изучения в объектах нескольких изосерологических систем и статистической обработки результатов исследования. Поэтому утверждающий вывод о происхождении исследуемых объектов от конкретного лица экспертыбиологи формулируют в виде суждения возможности (или не исключающего) без указания степени вероятности.

Нередко следствие встает перед выбором: ограничиться результатом биологической экспертизы или усилить доказательность полученной информации, дополнительно назначив молекулярно-генетическую экспертизу тех же объектов. Эта необходимость может возникнуть и по причине несовпадения результатов экспертизы с другими данными расследования.

Непременными условиями сопоставимости качества двух обсуждаемых типов экспертиз являются использование в биологической экспертизе всех возможностей расширения идентификации биоматериала и математикостатистический анализ результатов. Тогда преимуществом молекулярногенетической экспертизы следует считать более высокую чувствительность (к сожалению, оно относительно из-за возможности выявления материала, случайно привнесенного в объект). Основными достоинствами биологического исследования можно признать низкую себестоимость и краткие сроки.

Вероятностные расчеты принципиально возможны при любом объем исследований, но эксперты-биологи не используют их даже при исследовании нескольких систем крови (видимо, следуя стереотипам, сложившимся в течение многих лет, когда в арсенале методов для идентификации высохших следов была только система АВО). Между тем, математическая обработка результатов серологического исследования пятен, имеющих доказательную ценность, также может быть весьма полезной для следствия, если инкриминирующая вероятность (например, происхождение крови от потерпевшего - на одежде подозреваемого) значительно превышает 50%.

Распространенность генетически детерминированных маркеров – групп крови по мере открытия каждой новой изосерологической системы изучалась разными исследователями. Эти данные приводятся в иммунологической и судебно-медицинской литературе. Совокупная частота встречаемости комплекса признаков (трех-четырех изосерологических систем крови), выявленных в объекте, может оказаться в пределах 2-3%, иногда ниже и 1%, что соответствует высокой вероятности (97-99%) принадлежности материала конкретному лицу

(при совпадении его групповой характеристики с таковой объекта). Кстати, в альтернативном варианте экспертизы - типировании ДНК по трем генетическим системам показатель инкриминирующей вероятности колеблется в тех же пределах или выше лишь на несколько десятых долей процента.

Рациональность выбора серологической идентификации усматривает при расследовании дел с неизвестным преступником, и тем более, когда эксперту не могут быть представлены для сравнения даже образцы потерпевшего. В этом случае для следствия приобретает значение вероятность происхождения из одного источника нескольких следов, к примеру, изъятых из разных мест. С учетом высокой себестоимости молекулярно-генетической экспертизы при таких условиях (без образцов) её проведение неоправданно.

Показатели статистической вероятности случайного совпадения и вероятности идентичности сравниваемых объектов (при одинаковой многофакторной характеристике) конкретизируют идентификационную ценность биологического исследования.

Следует отметить, что эксперты-генетики при несовпадении аллелей в сравниваемых объектах, формулируя вывод, исключающий их идентичность, должны предусматривать частоту мутации генов (примерно 1% на каждый признак) и оговаривать вероятность ошибки исключения (при малом числе использованных тест-систем). В биологической экспертизе исключающий вывод всегда имеет категоричный характер – в виде отрицательного суждения действительности или суждения невозможности.

Когда образцы потерпевшего и подозреваемого в совершении преступления имеются, рационально заранее сориентировать следователя в отношении ожидаемой степени надежности выводов биологической экспертизы сразу после определения групповой характеристики участников происшествия. Если они различны, предполагая источник происхождения следов, с учетом распространенности той или другой совокупности признаков, следователь может принять обоснованное решение о назначении или отказе от дорогостоящей генетической экспертизы.

Можно полагать, что в подавляющей массе неосложненных расследований, сообразуясь с уже имеющейся изобличающей преступника информацией, следователь сочтет достаточной доказательность идентификации следов на вещественных доказательствах в рамках биологического исследования.

Возможно и противоположное решение, например, когда частота встречаемости групповой характеристики крови, имеющей доказательное значение, окажется не столь редкой, чтобы обеспечить высокую идентификационную значимость биологической экспертизы. Отказ от идентификации объектов биологическими методами может быть обусловлен и другими причинами: совпадением антигенных характеристик лиц, проходящих по делу, незначительным количеством материала, подлежащего экспертизе и т. п.

Объективно оценив предполагаемые шансы идентификации следов-улик биологическими и молекулярно-генетическими методами, следователь на первом

же этапе расследования получит возможность выбрать результативную и экономичную тактику получения информации.

Этот выбор может быть реализован следующими путями:

1. Назначением биологической экспертизы, когда можно ограничиться маркировкой следов в пределах одной или нескольких изосерологических систем. При этом в постановлении могут быть обозначены просьба об использовании

2.Отсроченным назначением первичной молекулярно-генетической экспертизы. После определения состава следов и групповой дифференцировки образцов причастных к делу лиц эксперт-биолог сообщает следователю о частоте встречаемости установленных групп крови, разъясняя значение этого показателя,

ивозможности идентификации следов с учетом их характера. Если по мнению следователя ожидаемая доказательная ценность серологической идентификации недостаточна, биологические исследования приостанавливаются. Следы идентифицируют с помощью МГА.

3.Назначением первичной комплексной биологической и молекулярногенетической экспертизы, что рационально при незначительных размерах следов. Оба типа исследования наиболее целесообразно поручить одному

следователем максимально выгодную тактику - серологического и генотипического или только последнего исследования.

Другой вариант: проведение такой экспертизы осуществляется двумя специалистами одновременно. При этом обязательно производится совместный рациональный отбор и разделение материала, квалифицированное исследование заканчивается беспристрастным обсуждением и составлением совокупных выводов. Такой подход предотвратит возможность возникновения разноречивых умозаключений, когда биологическая экспертиза проводится первично, а молекулярно-генетическая - дополнительно, и следствие встает перед выбором доверия той или другой экспертизе.

4. В случаях получения неудовлетворительных результатов (не соответствующих ожидаемым, или противоречащих другим данным расследования) первичной биологической, генетической или комплексной экспертизы может быть назначена дополнительная (биологическая или генетическая) экспертиза, как и повторная комплексная. Этот вариант наименее рационален при ограниченном количестве исследуемого материала, он чреват несовпадением выводов двух экспертиз по причинам, не зависящим от исполнителей. В материале, подвергнутом дополнительной (либо повторной) экспертизе, могут отсутствовать (или слабо проявлять себя) некоторые компоненты пятен, израсходованные в процессе первичного исследования и, наоборот, могут обнаружиться микроколичества постороннего, случайно привнесенного материала.

Поскольку МГА ДНК - дорогостоящее исследование, изучение всех объектов этим методом не всегда рационально. По-видимому, следует предусматривать тщательный отбор тех из них, дополнительное или первичное исследование которых необходимо по характеру следов. Такой дифференцированный подход положительно скажется на бюджете учреждения.

Можно предположить, что основную долю объектов на вещественных доказательствах, неоспоримо подлежащих первичному генотипическому исследованию, составят следы выделений (выделений, смешанных с кровью), предполагаемые обладатели которых имеют одинаковую группу крови по системе АВО (либо идентификации их биологическими методами препятствуют другие причины). Сюда же следует отнести следы крови чрезвычайно малых размеров, когда антигенная характеристика предполагаемых владельцев ее совпала по всем возможным для дифференцирования в пятнах системам. Большинство объектов, содержащих только кровь, с достаточно высокой степенью вероятности (при исследовании нескольких систем) могут быть идентифицированы традиционными иммунологическими и электрофоретическим методами.

Таким образом, расширенное изучение следов и сопровождение вероятностно-утверждающих выводов биологической экспертизы показателями идентификационной значимости (подобно используемому при обработке данных генетической экспертизы) создает условия для рациональной и эффективной тактики получения информации при расследовании преступлений.

Воеводина Л.Г., Исакова И.В.

ПОКАЗАНИЯ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ,

ИММУННЫХ, МОНОКЛОНАЛЬНЫХ СЫВОРОТОК ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ В ПЯТНАХ

Санкт-Петербург

На практике выявление группоспецифических факторов системы АВО в следах крови на вещественных доказательствах проводится, главным образом, двумя реакциями (реакцией абсорбции-элюции и реже – количественной реакцией абсорбции агглютининов - РАЭ и КРА). Обе реакции имеют как положительные, так и отрицательные стороны. В 1970 г. было выпущено методическое письмо «Определение групп изосерологической системы АВО в пятнах крови малой величины методом абсорбции-элюции при помощи изосывороток альфа и бета», МЗ СССР, 1970 г. Ранее использовалась только КРА. Данное сообщение посвящено, в основном, РАЭ с сыворотками анти-А и анти-В. Нами были проведены экспериментальные исследования с целью выявления: преимуществ и недостатков трех видов сывороток, использующихся в РАЭ для выявления антигенов в следах крови; влияния предмета-носителя; влияния примеси выделений, содержащихся в следах крови; возможности лучшего определения антигенов в слабо насыщенных (старых) следах, с различной силой антигенов. Параметры реакций подобраны по образцам крови известных групп и контрольной марли, на которой приготовлены образцы. В реакцию вводили высушенные на марле образцы выделений (слюны) разных групп - выделителей и невыделителей антигенов системы АВО, смешанные пятна крови со слюной. Для всех сывороток с соответствующими тест-эритроцитами, используемыми в дальнейшем в реакции, подобран титр 1:128; применена фиксация объектов спиртом в течение 20 минут. Абсорбция (в течение 18 часов при 4оС) и продолжительность отмывания подобраны для сывороток по образцам крови и контрольной марле. Элюцию проводили в физиологический раствор в течение 30 мин. при 52°С. Со всеми образцами крови в РАЭ были получены отчетливые специфичные результаты. При использовании слабо насыщенных следов с моноклональными сыворотками результат реакции - сомнительный (при относительно свежих пятнах, срок до I месяца). Все использованные экспериментальные пятна крови и слюны были приготовлены из «свежих» образцов, взятых в отделении и высушенных в надлежащих условиях. С образцами слюны невыделителей моноклональные сыворотки дали отрицательный результат - невыявление соответствующего антигена, что позволяет использовать эти сыворотки при некотором загрязнении предметаносителя выделениями (борьба с влиянием предмета-носителя). Остальные сыворотки (гетероиммунные гемагглютинирующие и изосыворотки) выявляли соответствующий антиген в слюне невыделителя; они непригодны, в случае

загрязнения предмета-носителя выделениями. В слюне выделителей с гетероиммуными сыворотками антигены выделений выявлялись соответствующим образом, не наблюдалась «блокада» антител. При использовании изосывороток и моноклональных (анти-А и анти-В) в части образцов антиген в РАЭ выявлялся, в других имела место полная или частичная «блокада» соответствующих антител сыворотки, что, очевидно, связано с присутствием в этом образце сильного антигена; кроме того, с таким образцом имела место «перекрестная» реакция с гетерологичной сывороткой.

В смешанных следах крови и слюны того же лица, являющегося невыделителем своего группового фактора, со всеми сыворотками были получены надлежащие результаты. В таких же следах крови со слюной от выделителей с гетероиммуными гемагглютинирующими сыворотками соответствующие антигены выявлялись достоверно; с изосыворотками и моноклональными (даже в случаях выявления соответствующих антигенов в раздельных пятнах) имела место блокада антител. В таких образцах выявлялся только антиген Н, хотя они были иной специфичности. Поэтому при работе с пятнами крови с возможной примесью выделений надо учитывать возможность невыявления группового фактора крови (как с изосыворотками, так и МКАТ) - ложно отрицательный результат.

В смешанных следах крови и слюны разных групп (слюна от невыделителя) групповые факторы крови выявляются четко; с гетероиммуными и изосыворотками в отдельных образцах выявлялись и антигены слюны, с моноклональными - только антигены крови. В смешанных следах крови и слюны выделителей разных групп (не совпадающих с группой крови) со всеми тремя сыворотками выявлялись антигены крови и слюны.

При использовании изосывороток и МКАТ для определения группы крови в следах её на предмете-носителе, значительно загрязненном выделениями лица-выделителя другой групповой специфичности, может иметь место ложно положительный результат - выявление в пятне крови антигена не крови, а выделения - при блокаде соответствующих антител за счет "сильного" антигена, содержащегося на предмете-носителе. В то же время, агглютинин, содержащийся в крови пятна, связывается гомологичным антигеном выделений предметаносителя, что снижает его блокирующее действие на антитела соответствующей сыворотки (снижение абсорбционной способности антигена). В элюатах из пятна наблюдается агглютинация тест-эритроцитов за счет антител, соединившихся при абсорбции с антигеном выделений; в контроле антиген остается более сильным и дает блокаду - отрицательный результат на заключительном этапе реакции.

Такая разница в результатах с различными сыворотками, очевидно, объясняется разным качественным составом тест-сывороток. Как известно, методическое письмо рекомендует использовать сыворотки в РАЭ с высоким титром - от 1:128 и выше, и создано это письмо для работы с изосыворотками. Известно, что антитела изосывороток (альфа-анти-А и бета-анти-В) являются антителами преимущественно класса IgM; в сыворотках с высоким титром присутствует то или иное количество антител класса IgG.

Сыворотки с моноклональными антителами (согласно аннотации) принадлежат к классу IgM. Гетероиммунные сыворотки, получаемые иммунизацией животных эритроцитами человека соответствующей специфичности, содержат больше антител класса IgG. Для реакции абсорбцииэлюции антитела тест-сыворотки должны обеспечивать подвижную, средней силы связь. Антитела класса IgM дают прочную связь, а потому, в случае сильного антигена (выделения от выделителя), дают феномен «блокады», комплекс антиген + антитело не распадается при фазе элюции.

Антитела класса IgG - дают довольно слабые подвижные связи, которые легко распадаются, поэтому такие сыворотки практически не дают блокады; однако после абсорбции могут распадаться, не достигнув фазы элюции, легко перемываются. Чтобы обеспечить необходимую РАЭ связь, создается избыток антител (сыворотки с высоким титром), чтобы не все валентности их были заняты для сывороток класса IgM (борьба с блокадой). Кроме того, антитела класса IgM плохо выявляют слабые свойства (недостаток антигенных детерминант – мало антител соединяется, соответственно мало выходит в элюат). Поэтому использование тех или иных сывороток в каждом конкретном случае для РАЭ зависит от выраженности антигена в пятне крови, влияния предмета-носителя, наличия примеси выделений, степени насыщенности пятна, «возраста» его, наличия или отсутствия микрофлоры.

Повышение чувствительности реакции ведет к уменьшению её специфичности, поэтому использование сывороток с высоким титром способствует проявлению влияния предмета-носителя, вызывает перекрестные реакции за счет микрофлоры в пятнах (табл. 1).

Во всех сомнительных случаях следует использовать различные методы фиксации, разные виды сывороток и титра их, учитывать влияние предметаносителя, проверив его в количественной реакции абсорбции, как и само пятно, если позволяют его размеры (рис. 1). Укорочение срока абсорбции возможно лишь при сильном антигене крови в пятне, т.к. слабые свойства и ненасыщенные пятна не дадут достоверных результатов.

Таблица 1

Результаты экспериментального исследования при использовании различных сывороток

для пятен крови и слюны (изолированных и смешанных)

Губайдуллин М.И., Сафин Р.Я.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ДАВНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ СМЕРТИ

Челябинск

Проблема определения давности наступления смерти остается одной из центральных в судебной медицине. Использование ограниченного круга стандартных параметров, основанных на оценке ранних и поздних трупных изменений, при исследовании давности наступления смерти не позволяет точно и надежно оценить интервал времени после наступления смерти [10]. Это привело к появлению новых методов по определению давности наступления смерти, основанных на исследовании биохимических, морфологических, серологических и иных изменений, происходящих в крови, цереброспинальной жидкости, стекловидной жидкости глаза и других жидкостях и средах организма [9].

Большое распространение получили работы, основанные на изучении посмертных изменений клеточных элементов крови, которые могут быть применены для определения давности наступления смерти [4,5,6,7,8]. Однако, в работах, посвященных данной проблематике, не выявлено сведений об изменении функциональной активности клеточных элементов трупной крови и недостаточно исследованы изменения количественного состава фракций лейкоцитов. Учитывая то, что для повышения степени точности методов по определению давности наступления смерти организма необходимо использовать многофакторный анализ (оценивать достаточно большое количество показателей) [8], вытекает потребность в исследовании ранее неизученных аспектов трупной крови.

Исследования выполнены на 35 образцах крови, полученных путем забора шприцем из полости левого желудочка сердца трупов людей с достоверно известным временем и обстоятельствами смерти. Затем кровь в количестве 10 мл смешивалась с раствором гепарина в разведении 1:10 (из расчета 25 ЕД гепарина на 1 мл крови). Исследование материала проводилось сразу же после забора.

Изначально был произведен подсчет процентного содержания нейтрофильных лейкоцитов в полученных образцах крови. Для этого из каждого образца крови бралось по 0,003-0,005 мл крови. Далее готовились мазки, которые высушивались, фиксировались в 96% этиловом спирте и окрашивались по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии подсчитывалась лейкоцитарная формула.

Функциональная активность нейтрофилов оценивалась с помощью исследования фагоцитоза (на модели поглощения частиц латекса диаметром 1,7 мкм (108 частиц/мл), полученного из ВНИИСК Санкт-Петербург) с определением активности фагоцитоза (процент нейтрофилов, захвативших хотя бы одну частицу латекса), интенсивности фагоцитоза (число поглощенных микросфер латекса на один подсчитанный нейтрофил) и внутриклеточного кислородзависимого метаболизма (оценка интенсивности реакции спонтанного и индуцированного теста восстановления нитросинего тетразолия) [1].

Поученные данные подвергли стат. обработке с использованием пакета статистических программ “Statistica, version 6.0” компании StatSoft, Inc.

Результаты данных исследований представлены в виде табл. 1, из которой следует, что величины исследованных иммунных показателей трупной крови снижаются в посмертном периоде, в зависимости от давности смерти.

Отмечается постепенное снижение процентного содержания нейтрофильных лейкоцитов трупной крови с увеличением посмертного интервала времени. Это согласуется с данными ранее проведенных нами исследований на трупах лабораторных животных и крови живых людей, хранившейся in vitro [2,3], а также других исследователей, которые отмечают полное разрушение нейтрофилов крови в результате аутолиза на сроках 66-96 часов после наступления биологической смерти организма или хранения крови in vitro [4,6,7].

При анализе данных о функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов трупной крови было выявлено резкое снижение в посмертном периоде показателей внутриклеточного кислородзависимого метаболизма, особенно величин индуцированного НСТ-теста, а показатели фагоцитарной активности клеток снижались несколько медленнее. Однако на сроках более 72-х часов от момента наступления биологической смерти функциональная активность нейтрофилов крови почти не определялась. Аналогичные результаты нами были получены при исследовании крови трупов лабораторных животных, а также при изучении образцов крови, забранных у живых людей и хранившихся in vitro [2,3].

Статистический анализ показал наличие значимых различий между значениями групп исследованных иммунологических показателей крови, в зависимости от давности наступления смерти организма, а также наличие отрицательных корреляционных связей между исследованными показателями трупной крови и временем, прошедшим с наступления смерти организма (при р < 0,05).

Таблица 1 Динамика изменений исследованных показателей нейтрофильных лейкоцитов трупной крови людей на различных этапах постмортального периода (M±m)