6 курс / Судебная медицина / Актуальные_вопросы_судебно_медицинской_экспертизы_трупа_В_Клевно

получения оптимального раствора с фиксацией наблюдаемых максимумов поглощения.

В зависимости от того наблюдается или нет в спектре анализируемого вещества максимум(ы) поглощения, а также по количеству, местоположению и интенсивности наблюдаемых максимумов поглощения более 200 веществ, включающих в себя наркотические средства, психотропные, сильнодействующие, ядовитые и лекарственные вещества, разделены на 5 групп:

1 группа – вещества, не имеющие максимумов поглощения. В молекулах соединений этой группы возможны электронные переходы типа σ→σ. Такие переходы осуществляются в вакуумной ультрафиолетовой области спектра (менее 200 нм) и не регистрируются в рабочем диапазоне обычных спектрофотометров;

2группа – вещества, имеющие 1 максимум поглощения;

3группа – вещества, имеющие 2 максимума поглощения;

4группа – вещества, имеющие 3 максимума поглощения;

5группа - вещества, имеющие 4 и более максимумов поглощения. Последние четыре группы составляют вещества, в молекулах которых

имеются хромофоры и сопряженные или несопряженные с ними ауксохромы. Учитывая это, соединения, включенные в эти группы, могут обладать всеми видами электронных переходов;

5-ая группа веществ, в спектре поглощения которых отмечается 4 и более максимумов поглощения, включает наименьшее количество веществ. При этом наличие полос поглощения в длинноволновой области УФ-спектра позволяет с достаточной степенью вероятности идентифицировать анализируемое соединение. Это в полной мере относится к спектрам поглощения хингамина, плаквенила, метадона и напроксена. Однако окончательный результат анализа

дифференциация хингамина и плаквенила, УФ спектры которых идентичны, возможна с применением тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

4-ю группу составляют достаточно большое количество веществ, имеющие идентичные УФ спектры с максимумами поглощения при 251-253 нм; 257-258 нм и 263-265 нм, и дифференциация, которых не может быть достигнута без применения дополнительных методов исследования. Вместе с тем в этой группе только на основании характера УФ спектра могут быть идентифицированы такие лекарственные вещества, как фтивазид, церукал, рифампицин, хинин, хинидин и другие.

Идентификация соединений 2-ой и 3-ей групп возможна на основании, как индивидуальных спектров, так и в комбинации с другими физико-химическими методами исследования.

С целью повышения надежности идентификации исследуемых веществ спектрофотометрическим методом необходимо стремиться к увеличению объема информации. Идентификация становится более надежной, если помимо

Вспектрах поглощения структурных аналогов этой группы соединений имеются три полосы поглощения с максимумами в диапазоне длин волн –200- 215; 220-240 и 290-330 нм. Две первые полосы поглощения соответствуют возбуждению ароматических хромофоров, а третья – связи -N=C= азометиновой группировки 1,4-бензодиазепинового цикла. Кроме того, для 1,2- дигидропроизводных 1,4-бензодиазепина, таких как оксазепам, нитразепам и других, характерна лактим-лактамная таутомерия, что обуславливает смещение максимума поглощения в длинноволновую область спектра в щелочной среде.

Соединения, имеющие в своей структуре фенольный гидроксил.

ВУФ-спектрах подобных соединений отмечается батохромный сдвиг, то есть смещение максимума поглощения в длинноволновую часть спектра, в результате ионизации молекулы и образования соответствующих «фенолятов». Так, УФ спектр поглощения морфина в 0,1 М растворе хлористоводородной

Влияние растворителя на спектр поглощения вещества.

Для некоторых соединений весьма информативным является снятие спектров поглощения в растворе 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты и в каком-нибудь растворителе. Чаще всего в качестве таких растворителей используются этанол или метанол. Так, сиднокарб в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты имеет два максимума поглощения при 234,8 и 293,2 нм, в 95% этаноле – при 256 и 340 нм. В спектре поглощения кислоты салициловой в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты наблюдаются два максимума поглощения при 237,3 и 303,1 нм, в 95% этаноле только один максимум поглощения при 298 нм.

Для получения максимальной информации, получаемой при использовании спектрофотометрии, необходимо снять УФ спектры в трех средах

– 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, 95% этаноле и 0,1 М растворе гидроксида натрия.

Однако для получения достоверного результата следует подтвердить предварительное заключение результатами других аналитических методов анализа – тонкослойной, высокоэффективной жидкостной, газожидкостной хроматографии, хроматомасс-спектрометрии, а иногда и инфракрасной спектрофотометрии.

Предлагаемая схема установления подлинности неизвестного вещества позволяет, прежде всего, систематизировать полученные данные, определить количество максимумов поглощения, а также сравнить полученный УФ спектр с атласом ультрафиолетовых спектров, подготовленным нами и насчитывающим 249 соединений.

Предложенная скрининговая система прошла апробацию в СПб ГУЗ « Бюро судебно-мединской экспертизы» и с ее применением идентифицированы в биологическом материале папаверин в смеси с дибазолом, флуконозол, сероквель, метотрексат и другие лекарственные вещества.

Бушуев Е.С., Горбачева Т.В.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО МЕТОТРЕКСАТА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Санкт-Петербург

Метотрексат по химической структуре (N-[4-[[(2,4-диамино–6–птеридил)- метил]-метиламино]-бензоил]-l-глютаминовая кислота) близок к фолиевой кислоте и является ее антиметаболитом-антагонистом. Это цитостатическое средство, назначаемое при острых лейкозах, лимфосаркоме, при комбинированной химиотерапии у больных раком молочной железы, легких яичников и др.

Препарат применяют при тщательном наблюдении врача, так как его употребление вызывает ряд побочных явлений – тошноту, диарею, стоматит, а при длительном назначении – язвенные поражения слизистой оболочки полости рта с кровотечениями, выпадение волос, анемию, тромбоцитопению с общей кровоточивостью.

Выпускается в виде таблеток по 2,5; 5 и 10 мг, а также в виде натриевой соли - лиофилизированной сухой пористой массы, желтого (по 0,005 г) и от темно-желтого до желто-коричневого (по 0,05 и 0,1 г) цвета, растворимой в воде.

Применяют метотрексат внутрь, а также в виде натриевой соли внутримышечно, внутривенно и интратекально. При приеме внутрь в малых дозах максимальная концентрация метотрексата в сыворотке крови наблюдается течение 1-2 часов. Период полувыведения (Т1/2) составляет 4-10 часов, а объем распределения (Vd)–около 0,8 л/кг.

Около 50-95% дозы выводится в неизмененном виде с мочой в течение 24 часов. Основными метаболитами являются 4-амино-10-метилптериновая кислота, 7-гидроксиметотрексат и 7-гидрокси-4-амино-10-метилптериновая кислота.

Вследствие узкого терапевтического интервала действия (близости

Доказательство метотрексата в биообъектах при судебно-химическом исследовании, а также в крови при проведении терапевтического лекарственного мониторинга является достаточно сложной аналитической задачей, вследствие отсутствия методов изолирования, его физико-химических свойств и растворимости.

Препарат практически не растворим в воде, этаноле, хлороформе и эфире, что не позволяет применять для выделения его из биообъектов общепринятые в химико-токсикологическом анализе методы изолирования подкисленной водой или этиловым спиртом (для биотканей), а также прямой жидкость-жидкостной экстракции (для биожидкостей).

Нами разработана методика изолирования метотрексата из биологического материала, в основу которой положена растворимость этого лекарственного вещества в ацетонитриле.

методами.

Высокоэффективная жидкостная хроматография Жидкостной хроматограф «Милихром 5». Колонка 80х2 мм с Сепароном

С18 (7 мкм). Элюент – 40% раствор ацетонитрила на фосфатном буфере (рН 6,1), скорость элюента 100 мкл/мин. Детектор ультрафиолетовый, аналитическая длина волны 220 нм. Время удерживания метотрексата составляет 1,64 мин. При этом пик, соответствующий анализируемому веществу, имеет максимумы поглощения при 260 нм и 304 нм.

Ультрафиолетовая спектрофотометрия Метотрексат в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты имеет

максимум поглощения при 242,7 нм и 306 нм, а в 0,1 М растворе гидроксида натрия – при 258 нм и 303 нм.

Тонкослойная хроматография Исследовано хроматографическое поведение метотрексата на пластинках

«Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в 6 системах растворителей (табл. 1).

Согласно данным, представленным в табл. 1, для идентификации метотрексата на пластинках «Сорбфил» могут быть использованы системы растворителей № 1, 2 и 3. Детекция метотрексата на хроматографической пластинке осуществляется по собственной желтой или оранжево-желтой окраске лекарственного вещества.

Обозначено: * n = 3

С применением разработанной методики выполнено судебно-химическое исследование внутренних органов и мочи от трупа гр-на А. в связи с подозрением на отравление метотрексатом. По результатам выполненного исследования было сделано заключение об отсутствии в биообъектах (тонкий кишечник, печень, почка, стенка мочевого пузыря и моче) метотрексата.

Вместе с тем на основании судебно-химического анализа с применением хроматомасс-спектрометрии, ультрафиолетовой спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии в крови гр-на А. установлено присутствие сильнодействующего вещества – фенобарбитала, наркотического средства – тримеперидина (промедола) и лекарственных веществ

– димедрола и флуконозола.

Бушуев Е.С., Горбачева Т.В., Бычков В.А.

ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО – ПИРИБЕДИЛ, КАК ОБЪЕКТ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Санкт-Петербург

Болезнь Паркинсона – одно из наиболее распространенных неврологических заболеваний, которое встречается, как правило, в пожилом и старческом возрасте.

Для фармакотерапии паркинсонизма применяют холинолитические средства (циклодол, бипериден), производные аминоадамантана (амантадина гидрохлорид и сульфат), ДОФА-содержащие средства (леводопа, бензеразид, карбидопа), ингибиторы МАО типа В (селегилин), ингибиторы катехол-О- метилтрасферазы (энтакапон) и агонисты дофаминовых рецепторов (перголид, бромокриптин, ропинирол, прамипексол) и другие.

Всудебно-медицинской практике неоднократно отмечались смертельные случаи отравления людей пожилого возраста лекарственными средствами, применяемыми для лечения болезни Паркинсона.

В2008 году нами проведено судебно-химическое исследование биообъектов от трупа гр-на Г., 80 лет, был обнаружен дома. Со слов

родственников труп пострадавшего был обнаружен дома. Известно, что умерший ежедневно принимал по 3-4 таблетки розового, желтого и белого цвета. На вскрытии у гр-на Г. дифференцирована гнойная пневмония.

На химическое исследование представлены желудок, почка, тонкий кишечник, печень, кровь, желчь и 12 таблеток, обнаруженные в разных отделах желудка.

Каждая таблетка или ее фрагмент помещались на отдельные часовые стекла и высушивались при комнатной температуре. При рассмотрении таблеток отмечена их идентичность – диаметр 8-9 мм, высота 3-4 мм, цвет – сероватый.

Каждая таблетка или фрагмент таблетки измельчались на часовом стекле и заливались 5 мл смеси хлороформ:этанол (1:1). Полученные спиртохлороформные извлечения исследовались нижеприводимыми методами.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области.

Остатки по испарении 10 мкл извлечений из таблеток и их фрагментов растворяли в 5 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и в 5 мл 96% этанола и снимали УФ спектры полученных растворов. При этом в спектральной кривой всех растворов извлечений в хлористоводородной кислоте имелись максимумы поглощения при 236 нм и 287 нм с инфлексией при 314 нм, а извлечения в этаноле - при 243 нм и 287 нм с инфлексией при 314 нм.

Согласно банку данных судебно-химического отделения СПб ГУЗ БСМЭ спектр поглощения в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты с двумя интенсивными максимумами поглощения при 236 ± 2 нм и 287 ± 2 нм имеют следующие лекарственные вещества – 3,4-метилендиоксиамфетамины (235+286 нм) и дипиридамол (237+284 нм).

Однако ни один из этих препаратов не соответствовал анализируемым таблеткам по следующим причинам:

а) извлечения из таблеток в отличие от 3,4-метилендиоксиамфетамины (МБДБ, МДМА) при взаимодействии с реактивом Марки не образуют синефиолетовое окрашивание, переходящее в зеленое, а затем в черное;

б) спирто-хлороформные извлечения из таблеток в отличие от дипиридамола не окрашены в интенсивно желто-зеленый цвет;

Тонкослойная хроматография.

По 10 мкл извлечений исследовали на 2 пластинках «Сорбфил ПТС-А- УФ» в системах растворителей: система 1 –метанол: 25% раствор гидроксида аммония (100:1,5) и система 2 –этилацетат: метанол: 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1). Пластинка 1. Система 1. Проявители – последовательно УФсвет, 3% раствор хлорида железа (III) и, наконец, реактив Драгендорфа. При наблюдении пластинки в УФ свете и проявлении пластинки раствором хлорида железа в зоне нанесения всех извлечений из таблеток флуоресценции и какоголибо окрашивания не наблюдалось. В зоне нанесения свидетеля-дипиридамола отмечено пятно с интенсивно зеленой флуоресценцией с Rf=0,71. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf = 0,84, а в зоне свидетелейанальгина и дипиридамола наблюдались оранжевые пятна с Rf = 0,82 и 0,71, соответственно. Пластинка 2. Система 1. Проявители – последовательно УФсвет, 3% раствор хлорида железа (III), а затем реактив Драгендорфа. При наблюдении пластинки в УФ свете и проявлении пластинки раствором хлорида железа в зоне нанесения всех извлечений из таблеток флуоресценции и какоголибо окрашивания не наблюдалось. В зоне нанесения свидетеля-дипиридамола отмечено пятно с интенсивно зеленой флуоресценцией с Rf = 0,64. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf = 0,82, а в зоне свидетелейанальгина и дипиридамола наблюдались оранжевые пятна с Rf = 0,82 и 0,64, соответственно.

Высокоэффективная жидкостная хроматография.

К остаткам по испарении 20 мкл извлечений из каждой таблетки добавлялось по 200 мкл 40% раствора ацетонитрила, и по 3 мкл полученных растворов исследовались методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при следующих условиях:

-жидкостной хроматограф «Милихром 5»; -колонка стальная 80х2 мм с Сепароном С18 (7 мкм);

-элюент – 40% раствор ацетонитрила в фосфатном буфере (рН 6,1); -скорость элюента 100 мкл/мин; -детектор ультрафиолетовый, аналитическая длина волны 220 нм.

На хроматограммах извлечений отмечены пики со временем удерживания 11,18 мин и спектром поглощения при 242+286 нм.

Таким образом, на основании результатов ультрафиолетовой спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной

хроматографии можно было заключить, что таблетки и фрагменты таблеток идентичны.

Для установления подлинности таблеток было проведено исследование методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

Хроматомасс-спектрометрия.

Газовый хроматограф Agilent 6890, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5МS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,32 мм и толщиной пленки 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5975.

Режим хроматографирования. Скорость газа-носителя 0,8 мл/мин. Деление потока 1:10, с задержкой включения 3 мин. после ввода пробы. Температура инжектора 250°С, интерфейса детектора 280°С. Температура колонки программируемая - начальная 80°С (1 мин.), затем нагревание колонки со скоростью 30°С/мин. до 130°С, затем повышение со скоростью 7°С/мин до 230°С и окончательно со скоростью 10°С/мин до 280°С с выдержкой при конечной температуре 10 минут.

Условия детектирования. Энергия электронов ионизации 70эВ. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования в интервале масс 30550 а.е.м.

Управление прибором и сбор данных проводился с помощью программного обеспечения MSD Chemstation vers. D.03.00.611. Обработка результатов и анализ данных – в Data Analysis и AMDIS. После хроматографирования пробы идентификация веществ проводилась по временам удерживания и совпадению масс-спектра вещества с библиотечным. Поиск

идентифицировано лекарственное средство перебедил, применяемое для лечения болезни Паркинсона.

Изолирование токсических веществ из биотканей (желудок, почка) проводилось подкисленным спиртом. После осаждения белков осуществлялась жидкость-жидкостная экстракция хлороформом при рН 2-3 и при рН 10 (после добавления 25% раствора гидрокисда аммония).

Для выделения токсических веществ из крови (2 мл) применялась прямая жидкость-жидкостная экстракция хлороформом при рН 2-3 и при рН 10 (после добавления 25% раствора гидроксида аммония).

По испарении хлороформно-кислых извлечений из внутренних органов наблюдались остатки желтоватого цвета. Остатки растворялись в 5 мл хлороформа и полученные растворы исследовались нижеприводимыми методами.

По 1 мл извлечений исследовали на пластинке «Сорбфил ПТС-А-УФ» в системе растворителей – бензол:диоксан: 25% раствор гидроксида аммония (60:35:5). Проявители – последовательно УФ-свет, реактив Драгендорфа. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf = 0,44, соответствующие по

окраске и значению Rf дипиридамолу. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета с Rf = 0,88 и 0,44, а в зоне свидетелей – пирибедила и дипиридамола наблюдались оранжевые пятна с Rf = 0,88 и 0,44, соответственно.

При исследовании в тонком слое сорбента извлечения из крови флуоресцирующих пятен не отмечено, а при обработке пластинки реактивом Драгендорфа наблюдалось оранжевое пятно с Rf = 0,88.

При спектрофотометрическом исследовании в спектре поглощения извлечения из желудка в 96% этиловом спирте отмечены максимумы поглощения при 279,8+289,7+309,8 нм, а из почки – при 275,3 нм. В этих условиях в спектральной кривой раствора пирибедила наблюдались максимумы поглощения при 244,6 нм и 287,7 нм, а раствора дипиридамола – при 284,8 нм и 308,4 нм.

Результаты тонкослойной хроматографии и ультрафиолетовой спектрофотометрии позволяют предположить наличие в извлечениях из внутренних органов двух веществ – пирибедила и дипиридамола.

Этот предположение было подтверждено результатами исследования извлечений желудка, почки и крови из щелочной среды методами ультрафиолетовой спектрофотометрии, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также хроматомасс-спектрометрии.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области.

Остатки по испарении по 0,5 мл извлечений растворяли в 5 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и снимали УФ спектры полученных растворов на спектрофотометре «СФ-2000-01» в пределах 220-360 нм в кварцевой кювете толщиной слоя 1 см. При этом в спектральной кривой извлечения из желудка отмечены максимумы поглощения при 238 нм и 282,7 нм, а извлечения из почки – максимум поглощения при 243 нм с инфлексией при 278 нм.

Одновременно снимались спектры поглощения пирибелила, дипиридамола и карбамазепина в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. При этом в их спектрах наблюдалось по 2 максимума поглощения: у пирибедила - при 235,9+287,1 нм, дипиридамола – при 238,0+282,7 нм, у карбамазепина – при

236,5+285,6 нм.

Тонкослойная хроматография.

По 1 мл извлечений исследовали на 3 пластинки «Сорбфил ПТСХ-А-УФ» в системах растворителей: система 1 – метанол: 25% раствор гидроксида аммония (100:1,5), система 2 – этилацетат: метанол: 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1) и система 3 – бензол: диоксан: 25% раствор гидроксида аммония (60:35:5). Проявители – последовательно УФ-свет, 3% раствор хлорида железа (III) и, наконец, реактив Драгендорфа. Пластинка 1. Система 1. При наблюдении пластинки в УФ свете в зоне нанесения извлечений, кроме крови, наблюдались пятна с интенсивной зеленой флуоресценцией с Rf = 0,84, соответствующие по окраске и значению Rf = 0,84 свидетелю-дипиридамолу. При обработке пластинки раствором железа в извлечениях отмечены пятна розоватофиолетового цвета с Rf = 0,76, соответствующие метаболиту анальгина –4- монометиламиноантипирину. При последующей обработке пластинки реактивом Драгендорфа в зоне нанесения извлечений наблюдались пятна оранжевого цвета