1.4. Возрастные изменения других клеточных структур и функций

Возникающий при «митохондриальном» старении пероксидативный стресс затрагивает в той или иной степени все структуры клетки, нарушает многие метаболические и регуляторные процессы в ней. Такое состояние усугубляется в связи с данными о продуцировании АФК и пероксисомами, участии этих АФК в изменениях клеточного метаболизма и индукции старения (Del Pio et al., 1998). По существу, дестабилизационные процессы в клетке как основной структурно-функциональной единицы организма, элементарной живой системы приобретают глобальный характер.

1.4.1. Снижение интенсивности митохондриального дыхания при старении, ослабляя эффективность главной, антикислородной ступени в антиоксидантной системе клетки, негативно отражается на функционировании последующих антирадикальной и антиперекисной линий защиты (см. п.1.1.1). Последние в этом «гипероксическом» случае, очевидно, не справляются с перегрузкой, на которую они не «рассчитаны», и постепенно истощаются. Следовательно, по указанной причине с возрастом падает эффективность многоуровневой антиоксидантной системы клетки в целом. Действительно, угасание активности ферментных и неферментных антиоксидантных систем и соответственно увеличение концентрации продуктов перекисного окисления вносит существенный вклад в старение клетки (Sohal, 1987). Это связано с возрастанием дисбаланса ∆ (ПО – АО) в клетках организма вне зависимости от принадлежности последнего к какому-либо эволюционному виду. Наиболее прямые доказательства зависимости скорости старения и продолжительности жизни от уровня свободных радикалов О₂ в организме получены на насекомых (Agarwal, Sohal, 1994; Dudas, Arking, 1995).

«Срыв» системы ферментативной защиты от свободнорадикального окисления липидов объясняет увеличение интенсивности ПОЛ печени у старых крыс-самцов линии Wistar (Никитченко, Лемешко, 1988). Исследование же активности SOD в головном мозге 11 видов животных с различной продолжительностью жизни выявило положительную корреляцию этой активности с максимальной продолжительностью жизни (Ono, Okada, 1984). Эти и другие подобные им факты позволяют думать, что здесь существует более общая закономерность, а именно: запрограммированность продолжительности жизни вида в значительной степени определяется эволюционно сложившимся соотношением между уровнем и надёжностью антиоксидантной системы клетки, с одной стороны, и заданной интенсивностью окислительного метаболизма, с другой (см. п. 1.9.1). В разные периоды жизни это соотношение изменяется. На ранних этапах онтогенеза умеренно повышенный уровень ПОЛ способствует нормальному росту и развитию организма, которые с возрастом постепенно замедля-ются и сменяются усилением процесса старения. На каком-то этапе пероксидативная составляющая повышается до значений, опасных в отношении канцерогенеза и других возрастных заболеваний. В позднем онтогенезе интенсивность окислительного метаболизма несколько снижается, с чем могут быть связаны известные факты некоторого омоложения систем организма и его «вторичного» старения (см. п.1.6.1).

Вообще, данных об изменении белков в тканях в ходе индивидуального роста и развития организма имеется большое количество. Качественные изменения их при старении подробно изложены были ещё в обзоре Ротштейна (Rothstein, 1975), однако механизмы этих изменений тогда считались изучен-ными недостаточно. По некоторым неантиоксидантным ферментам картина в последние годы всё же проясняется. В частности, причины снижения актив-ности аденилатциклазы и его последствия при старении уже были рассмотрены нами в п.1.3. Активация же гуанилатциклазы с возрастом, наоборот, повыша-ется, и этот факт тоже связан с происходящими при старении пероксигеназ-ными процессами. Гуанилатциклаза, как известно, активируется оксидантами различной природы, в том числе радикалами О , ОН˙ и перекисями липидов (Садовникова, 1989; Федоров и др., 1990). О₂-зависимая активация этого фермента в гипероксических условиях должна приводить и к увеличению содержания сGMP. Повышение активности гуанилатциклазы при гипероксии и старении чётко показано, например, в следующем эксперименте. У 1 – 24-месячных крыс в лёгком измеряли активность гуанилатциклазы. Измерение проводили и у 3-месячных крыс после их 7-дневного выдерживания в атмосфере с 95 % О₂. Обнаружили, что в норме активность гуанилатциклазы увеличивается с трёх до 24-месячного возраста, а гипероксия индуцирует 5-кратное повышение активности фермента (Maria et al., 1989).

В связи с указанными материалами некоторые исследователи обращают внимание на зависимость между активностью гуанилатциклазы и продолжи-тельностью жизни животных. Так, по наблюдениям Кольтовера (1986), между активностью этого фермента в клетках млекопитающих разных видов и обрат-ной величиной максимальной продолжительности жизни существует линейная корреляция с коэффициентом корреляции 0.977, которая чёткого объяснения пока не имеет. Если исходить из того, что с активностью сGMP обычно ассоциируется его причастность к пролиферации клеток, то наблюдения в животном мире отчасти подтверждают такую связь: быстро растущие организмы с высокой скоростью метаболических процессов и с частой сменой поколений действительно имеют низкую продолжительность жизни. Но, возможно, никакой взаимосвязи между указанными параметрами нет вообще, и мнимую корреляцию можно объяснить следующим образом.

Возрастающие гипероксия и пероксидация в клетках стареющего орга-низма, вызывая возрастные изменения, одновременно повышают активность гуанилатциклазы, т.е. изменение последней происходит параллельно, независимо от процессов старения. Зависимость их от общего причинного фактора, с одной стороны, и одновременное, хотя и самостоятельное, их изменение, с другой, создает ложное впечатление того, что усиление активности гуанилатциклазы причастно к снижению продолжительности жизни. По-видимому, при каком-то повышенном уровне дисбаланса Δ (ПО – АО) определяющие старение процессы превалируют над митогенным действием сGMP, однако в позднем онтогенезе в связи с некоторым снижением в клетках величины Δ (ПО – АО) это «ограничение» снимается и участие сGMP в пролиферации может возоб-новляться вновь, проявляясь в феномене обновления тканей и омоложения организма (см. п.1.6).

Небезынтересны также исследования, согласно которым при старении крыс в их почечной ткани возрастают связанные между собой активность ядерного фактора NF-kB, содержание мРНК циклооксигеназы-2 (COX-2) и самой COX-2 и определяемое COX-активностью накопление АФК. Ограничение же рациона животных снижает все эти негативные проявления (Chung H.-Y. et al., 1999). Пока неизвестно, происходит ли усиление пероксигеназных процессов при участии COX-2 и в других тканях стареющего организма. Если таковое будет установлено, то это – дополнительный канал, поддерживающий и углуб-ляющий кислородно-перекисное состояние в клетках и тканях при старении.

Нарушение функциональных свойств ферментов и других белков при ста-рении, несомненно, связано с изменением структуры их молекул в процессе функционирования, т.е. на посттрансляционном этапе, хотя в принципе такие изменения возможны и в процессе их синтеза. Наиболее реальны возрастные нарушения структуры и функции белков в результате их окислительной модификации (Дубинина, Шугалей, 1993). Например, при старении крыс, а также при повышении времени выдерживания их в атмосфере 100 %-ного О₂ в гепатоцитах накапливаются окисленные белки, в частности окисленные глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и глутаминсинтетаза, активность которых отличается от таковой в норме (Starke-Reed, Oliver, 1988). У старых крыс линии Fischer 344 степень окислительной модификации белков мозга и печени существенно выше, чем у молодых. По мере старения этих животных в большинстве тканей снижалась также активность антиоксидантных ферментов (Tian et al., 1998). Данные обзора современных работ, касающихся окисления белков при старении организма и при различных заболеваниях (Stedman, Berlett, 1998), показывают, что АФК, генерируемые обычными метаболическими процессами или состоянием окислительного стресса, способны окислять белки непосредственно или с помощью модифицированных окислением липидов и углеводов, которые взаимодействуют с функциональными группами белков.

Больше всего получено фактов по окислению белковых SH-групп при ста-рении, что, очевидно, связано с высокой чувствительностью к окислительной модификации аминокислотных остатков, содержащих серу. Если обратимые окисление и восстановление, в частности, цистеина и метионина являются в норме частью механизма клеточной регуляции, то при избыточном дисбалансе ∆ (ПО – АО) в стареющих клетках работа этой части сигнальных систем может становиться дефектной. Например, окисление метионина до метионинсульфоксида в сигнальных белках (в ионных каналах и др.) влияет на их функцию, а метионинсульфоксидредуктаза, восстанавливая метионинсульфоксид до метио-нина участвует в репарации модификаций белков, связанных со старением и дегенеративными заболеваниями (Hoshi, Heinemann, 2001). Данный механизм репарации, как и многие другие регуляторные системы вообще, функционирует, очевидно, лишь в определённом достаточно узком диапазоне возрастания дисбаланса ∆ (ПО – АО). В случае же превышения этого рабочего диапазона процесс репарации модифицированных белков необратимо нарушается, что, скорее всего, и происходит со временем при старении и возрастных болезнях.

Как маркёр старения клеток часто рассматривают также накопление в них белковых карбонилов (БК). Так, во фракциях белков из ядер, цитоплазмы и митохондрий, извлечённых из клеток печени и селезёнки старых (27 мес.) крыс, содержание БК значительно превосходило таковые показатели у молодых (4 мес.) животных (Плешакова и др., 1997). Образование БК в процессе старения крыс происходило во многих органах и тканях, но наиболее значительным оно было в почках и сывороточном альбумине (Goto et al., 1999). Локализация БК при старении и различных патологических состояниях совпадала с локализа-цией продуктов липопероксидации как, например, в стенке артерий больных сахарным диабетом. А инкубация белков in vitro с арахидоновой кислотой акти-вировала образование БК, MDA и 4-гидроксиноненаля, т.е. данная кислота – потенциальный стимулятор окислительной модификации белков (Miyata et al., 1998). Кстати, усовершенствованная методика определения в белках карбонильных остатков после окислительного стресса позволяет измерять пикомолярные их концентрации и вполне пригодна для изучения повреждений в белках, происходящих при старении организма и в других случаях (Handelman et al., 1997). Связанные с возрастом рост чувствительности к протеолизу и повы-шение антигенности белков, определяются не только накоплением карбониль-ных групп в них, но и другими возрастными специфическими модификациями (Газиев и др., 1998).

Вероятным механизмом посттрансляционной модификации белков при старении может быть и неферментативное гликозилирование (гликирование) –химическая реакция, в которой глюкоза связывается со структурными и энзи-матическими белками даже в здоровом организме (Knatowski, 2000). Данный эффект «обязан» часто возникающему в процессе нормального старения соче-танию гипергликемии и гиперинсулинемии, возрастному снижению толерант-ности к глюкозе (см. п.1.7.2.1, 1.7.2.2; Paul, Bailey, 1999). Вместе со свобод-норадикальным окислением гликирование белков является одной из причин разрушения клеток и тканей при старении, например, ткани почек стареющих крыс, получавших стандартный корм (Reckelhoff et al., 1998). Накопление продуктов гликирования в головном мозге считают характерным признаком старения и дегенерации, особенно при болезни Альцгеймера; эти продукты и окислительный стресс по принципу обратной связи инициируют переход обычных возрастных изменений в каскад патофизиологических процессов (Münch et al., 1997). Взаимодействие глюкозы с аминогрупами белков, например коллагена, может служить причиной возрастных утолщений артериальных стенок, сниже-ния элестичности соединительной ткани и подвижности суставов, дряблости скелетной мускулатуры и, таким образом, тоже вносить вклад в старение орга-низма (Melton, 2000; Knapowski, 2000).

Наконец, интересной представляется точка зрения, согласно которой увели-чение концентрации повреждённых белков в процессе старения происходит из-за замедления скорости их обновления. А оно, в свою очердь, связано с уменьшением концентрации рибосом, так как последние сами состоят из белков, повреждаемых при старении (Рязанов, 2001). Здесь, однако, уместным кажется следующее дополнение (см. также п. 2.3.7). Повышение уровни ПОЛ в стареющих клетках ведёт к разобщению рибосомомембранной связи, что вызы-вает дефицит мембранносвязанных полирибосом. В результате снижается коли-чество синтезируемых на них глутамат- и малатдегидрогеназ, цитохрома с, белков внешней мембраны митохондрий (Бердинских, 1983), а также специфи-ческих для дифференцированных клеток белков. Таким образом, если старение и продолжительность жизни отчасти и определяются содержанием рибосом, то, скорее всего, снижением количества тех из них, которые связаны с мембранами и синтезируют специальные белки.

Накопление окисленных белков при старении приводит, помимо указанных выше, и к ряду других патофизиологических сдвигов. К их числу относятся, предположительно, изменения в функционировании протеасомного механизма первичной днградации белков (Grune, 2000). Как известно, до 90 % всего клеточного белка (все короткоживующие, 70-90 % долгоживущих белков, в том числе ключевые регуляторные белки) подвергаются АТР-зависимой утилизации 20S протеасомами (Voges et al., 1999). Осуществляя такую деградацию, протео-литический путь играет в норме важную роль в регуляции основных клеточных процессов – деления, дифференцировки, апоптоза, репаорации ДНК и др. (Абрамова и др., 2002). При нарушении же механизма протеолиза низбежны, очевидно, различные заболевания, коррелирующие, по указанным представ-лениям, со старением.

1.4.2. Микросомальные мембраны, как и митохондриальные, легко подвергаются окислительному разрушению. Вероятно, поэтому при старении клеток уменьшается количество рибосом, связанных с мембранами, и соответственно сокращается шероховатый эндоплазматический ретикулум (см. Канунго, 1982). Между тем хорошо известно, что специальные белки на «экспорт», необходимые для решения внешних общеорганизменных задач, синтезируются в основном на мембраносвязанных полирибосомах, а белки для собственных, внут-ренних потребностей клетки – на свободных. Следовательно, в стареющем организме вследствие пероксидантного стресса интенсивность синтеза специальных белков должна падать при относительно стабильном синтезе белков для собственных нужд клетки (Kim et al., 1982). Об уменьшении с возрастом площади поверхности эндоплазматической сети и количества рибосом на мембранах сообщали и другие исследователи (см. Фролькис, Ступина, 1982). При ста-рении изменяется изоферментный состав цитохрома Р-450 и физико-химичес-кие свойства мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов, снижается детоксикационная функция печени. Более того, усматривают взаимосвязь между активностью ферментов микросомального окисления печени и продолжите-льностью жизни, если предположить, что высокий уровень детоксикационных процессов – один из механизмов, определяющих более длительную индивидуальную продолжительность жизни (Парамонова, 1997).

При клеточном старении происходят также модификация синтеза и конфорационные изменения белков цитоскелета, отражающиеся на синтезе ДНК и структуре хроматина. Например, при старении культуры фибробластов человека (штамм WI-38) показаны изменение структуры микротрубочек и связанные с ним увеличение доли полиплоидных клеток и снижение пролиферативного потенциала (Raes, Remacle, 1987; см. также ниже). Считают, что изменение структуры белков цитоскелета в процессе старения клетки имеет прямое отношение к нарушению путей передачи внутриклеточных сигналов в ядро (Macieira-Coelho, 1989).

«Пероксидативное» старение распространяется и на ядерные структуры, что существенно изменяет их функции. Об этом свидетельствуют достаточно убедительные факты. Обнаружены глубокие изменения в составе и содержании липидов структур ядра, непосредственно участвующих в процессах репликации и транскрипции (Никитин, 1988), при ПОЛ хроматина нарушается регуляция этих процессов (Воскресенский, 1986). Окислительные свободные радикалы участвуют в изменении структуры гистонов и негистоновых белков, в образо-вании ДНК-белковых сшивок, которые с возрастом накапливаются (Бердышев, Закария, 1991). Такие сведения приводились во многих работах и раньше. Они отражены, например, в подробном обзоре Садовниковой (1986). Отмечалось, в частности, что при старении гепатоцитов, фибробластов и лимфоцитов в их ядре накапливаются дефекты, которые могут быть результатом повреждаю-щего действия свободных радикалов и вторичных продуктов ПОЛ: одноните-вые разрывы, нарушение метилирования, падение активности ДНК- и РНК-полимераз и матричной активности, увеличение прочности связи ДНК с бел-ком, количества S-S сшивок, числа хромосомных аббераций и сестринских хроматидных обменов.

Среди более поздних работ такого рода (Leonhardt et al., 1992; Srivastava et al., 1993; Mizuuchi et al., 1994 и др.) обращают на себя внимание следующие. Во фракции ядер клеток печени крыс (возраст их 2 дня, 6 мес) определяли активности РНК- и ДНК-полимераз, сфингомиелиназы и ДНК-метилтрансферазы. У новорожденных эти активности были выше соответственно на 18, 25, 27 и 610 % по сравнению с взрослыми крысами. В целом было констатировано, что «постнатальный период онтогенеза сопровождается существенным изменением структуры ДНК и уменьшением активности энзимов, обслуживающих важнейшие генетические процессы в клетках животных» (Романенко и др., 1998). В образцах тканей сердца, головного мозга, почек, печени и лёгких ускоренно стареющих короткоживущих мышей линии SAMP1 обнаружено значительное возрастзависимое увеличение количества поперечных сшивок ДНК-белок. У долгоживущих же мышей линии NMRI такой факт зафиксирован только в тканях сердца и головного мозга, что объясняют отсутствием митотической активности в этих органах (Zahn et al., 1999).

Известны также факты ослабления при окислительном стрессе связи ДНК с факторами транскрипции, в частности с фактором Sp1, имеющие место, как полагают (Cimino et al., 1994), и при старении. В этой работе обсуждены генно-инженерные эксперименты, показавшие снижение транскрипционной активности гена каталазы и уменьшение связи ДНК с глюкокортикоидным рецептором в клетках, повреждённых окислительным стрессом. По тем же «пероксидативным», вероятно, причинам ДНК-полимераза из старых организмов гораздо чаще ошибается, включая в яДНК некомплементарные нуклеотиды (Holliday, Kirkwood, 1981). Накапливаются также анэуплоидные и полиплоидные клетки (см. Scheider, 1985).

Некоторые исследователи «запуск» процесса старения связывают только с возрастным накоплением повреждений яДНК. Последние в соматических клетках могут возникать при эндогенных процессах окисления, деметилирования, деаминирования и депуринизации, но окисление считают основным типом повреждения яДНК, способным предотвращать её репликацию и тем самым останавливать процесс деления клеток (Ames, 1989). Материалы об окислительной модификации яДНК при старении различных органов экспериментальных животных появляются достаточно часто. Например, в одной из обстоятельных публикаций на эту тему подобная модификация была показана в печени и лёгких крыс, причём она происходила не только при старении, но и в процессе химического канцерогенеза (Wang Y.-J. et al., 1995). Ряд других исследователей (Leff, 1994; Sohal et al., 1994) также причиной старения считают повреждение свободными радикалами главным образом яДНК. В частности, нарушения структуры хроматина в стареющих клетках человека объясняют наличием нерепарированных однонитевых разрывов яДНК, возникающих в результате свободнорадикальных реакций окисления (Puvion-Dutilleul, Sarasin, 1988). Более того, яДНК, претерпевая в течение всей жизни модификацию под действием активных форм кислорода и азота (даже при наличии системы репарации), вносит вклад в развитие также возрастных болезней, в том числе возрастного рака (Falaschi et al., 1997; Beckman. Ames, 1998).

Действительно, в различных тканях животных и человека происходит зави-симая от возраста аккумуляция продукта окислительной деградации яДНК 8-гидрокси-2´-дезоксигуанозина (8-oxodG), рассматриваемого как маркёр такого повреждения (Fraga et al., 1990; Meydani et al., 1997). По накоплению этого продукта судили, в частности, о степени старения диплоидных фибробластов человека линии JMR-90. Снижение же уровня окислительных повреждений ДНК удлиняло срок репликативной жизни и повышало скорость роста фибро-бластов (Chen et al., 1995). Между повышающимися с возрастом уровнями 8-oxodG и поперечных связей ДНК-белок в органах мыши имеется строгая корреляция, подтверждающая вклад оксидативных механизмов в указанные повреждения в ядре (Izzotti et al., 1999). При изучении же маркёров окислительного повреждения ДНК и липидов у людей в возрасте от 25 до 93 лет выявлена корреляция между возрастными увеличениями 8-oxodG и MDA в мышцах человека, с чем связывается потеря мышечной силы и выносливости при старении (Mecocci et al., 2000).

Образование 8-oxodG при старении и канцерогенезе вследствие действия свободных кислородных радикалов на геномные двухцепочечные молекулы ДНК часто приводит к нуклеотидным заменам типа Г→Т (Kamiya, Kasai, 1995). В эндогенное окисление яДНК, как показано в экспериментах на крысах (Жижина, Блюхтерова, 1997а), существенный вклад (не менее 50 %) вносят ионы железа и меди. Заметным также было влияние продолжительного приёма животными Se-дефицитной пищи. Напротив, использование комбинации различных антиоксидантов, в частности, напитка, содержащего аскорбиновую кислоту, каротин, витамин Е, экстракты зелёного чая и семян подсолнечника, повы-шала во фракции митохондрий гомогената стриатума и переднего мозга крыс Wistar активность SOD, понижала содержание продуктов ПОЛ в коре мозга и в мозжечке, противодействовала локальному образованию 8-oxodG при введении FeCl₃ в кору мозга (Komatsu, Hiramatsu, 2000). Уместно указать здесь и на новую процедуру детекции окислительных повреждений ДНК у здоровых пожилых людей и больных раком. В основе этой процедуры лежит реакция пов-реждённой ДНК с моноклональными антителами к ней. Такие специфичные антитела действительно были получены и они не взаимодействовали с ДНК молодых людей (Ashok et al., 1998).

Накапливающиеся с возрастом повреждения в яДНК сходны с теми, которые индуцируются ионизирующим излучением, теплом и некоторыми химическими мутагенами, причём действие природных средств защиты от старения в определённой степени сходно с механизмами резистентности к целому ряду экстремальных воздействий, вызывающих повреждения ДНК (Виленчик, 1989). Следует также иметь в виду, что в некоторых случаях накопление повреждений (количества разрывов) ДНК по мере старения клеток может происходить по не связанным с апоптозом механизмам, поскольку отсутствует характерная для апоптоза «нуклеосомная лестница». Такие данные получены, в частности, для стареющих нейронов (Mandavilli, Rao, 1996).

По обсуждаемому вопросу существуют и другие мнения. По данным, например, Когана (1984), имеющиеся экспериментальные материалы не подтверждают ведущей роли дефектов репарации и возрастных изменений яДНК в старении. Не играют важную роль и ошибки трансляции в процессах старения. Изменения в структуре яДНК влияют на возрастные дефекты транскрипции постольку, поскольку сказываются на структуре хроматина и конформации белков, несущих регуляторные функции. Центральное же место в молекулярно-генетических механизмах старения занимают возрастные изменения системы контроля экспрессии генов. В ряде работ эта точка зрения, похоже, нашла подтверждение. Особенно интересными представляются следующие факты.

При старении мышей во многих тканях и в клетках кроветворной системы активируется редокс-регулируемый фактор транскрипции NF-kB. Активность последнего, индуцируемая окислительным стрессом, ведёт к стимуляции образования ряда провоспалительных цитокинов, что существенно для патогенеза многих возрастных болезней (Poynter, Daynes, 1998). К тому же, активированный NF-kB может проявлять антиапоптозное действие (см. п. 7.1.9), тем самым способствуя, очевидно, поддержанию патологического состояния. В репликативно стареющих фибробластах WI-38 и IMR-90 человека зарегис-трировано значительное снижение ДНК-связывающей активности факторов транскрипции семейства OXBOX-REBOX. Эти факторы в норме тяготеют к взаимодействию с промотором некоторых ядерных генов, кодирующих митохондриальные белки дыхательной цепи. Моделирование репликативного ста-рения фибробластов кратковременным УФ-облучением приводило к тому же эффекту (Lehtinen et al., 1996). При болезни Альцгеймера, приуроченной, как известно, к пожилому возрасту и в патогенезе которой решающую роль играет окислительный стресс (см. п.1.7.3.1), в ассоциативной зоне коры больших полушарий снижен на 50-60 % от нормы уровень мРНК субъединицы IV цитохром-с-оксидазы (кодируется ядерным геномом) и субъединицы I этого же фермента (кодируется геномом митохондрии). В двигательной зоне коры такого отклонения нет (Chandrasekaran et al., 1997). Показанная в цитированных работах корреляция периода старения с процессами, определяющими на разных уровнях функционирования клетки ограничение митохондриального дыхания, представляется нам закономерной. В таком случае кислородно-перекисная концепция старения, опирающаяся прежде всего на указанное положение, получает более веское обоснование.

1.4.3. Точка зрения многих исследователей склоняется всё же к тому, что один из основных компонентов, ответственных за старение, имеет отношение к возраст-зависимым реорганизациям не только мтДНК, но и яДНК эукариотической клетки (Осивец, Хаманн, 1997). В связи с этим обратимся к весьма популярной, особенно в 90-х годах, теории теломерного старения и иммортализации соматических клеток (Оловников, 1971; Olovnikov, 1973, 1996; Harley, 1991 и др.). В её основу положено явление неполной репликации концов хромосом из-за особенностей молекулярного механизма репликативного синтеза ДНК, что приводит к укорочению в каждом митозе теломер – структур на концах хромосом, состоящих из многократно повторяющихся последовательностей ДНК. По достижении некоторой минимальной длины теломер клетка теряет способность к делению, что воспринимается как репликативное старение её. При компенсации утерянных теломерных участков ДНК новыми за счёт активации фермента теломеразы способность клетки к пролиферации сохраняется. Если же необходимая длина теломер поддерживается стабильно, то в принципе возможен переход клетки в состояние иммортализации.

Молекулярная логика этих и других процессов, связанных с теломерами, может стать более понятной, если принять во внимание структурную роль теломер в организации ядра клетки. Высокоспецифичное положение теломер внутри ядра, зависимое от взаимодействия их с ядерными мембраной и матриксом (Luderus et al., 1996) и, возможно, с цитоскелетом, определяет расположение и правильное функционирование в ядре хромосом. Взаимодействуют теломеры и друг с другом, образуя кластеры (см. обзор: Куренова, Мейсон, 1997). Более того, теломерные последовательности ДНК диспергированы по разным участкам внутри хромосом и отличаются своей чувствительностью к хромосомным разрывам и рекомбинациям (Balajee et al., 1996; Спитковский, 1997). В обзорной работе Егорова и соавт. (1997) обсуждается любопытное объяснение того, как устроен и действует механизм контакта теломеры с внутриядерными структурами. Авторы отмечают, в частности, что пространственно теломера компактизована. У человека, например, теломерный повтор образует петли размером 2 т.п.н., компактно расположенных вокруг некоего образования из ядерного матрикса. Последний содержит в своем составе специальный теломеросвязывающий белок. Петли собираются и разбираются в каждом клеточном цикле. Если длина теломерного повтора уменьшается до такой степени, что не позволяет образоваться хотя бы одной петле, то связь ДНК с матриксом ослабляется или становится вообще невозможной. Этот момент соответствует индукции старения. Обычно контакт теломерного повтора с матриксом теряется в конце деконденсации хромосом, что объясняет остановку стареющих клеток в начале периода G₁ (Sherr, Roberts, 1995 – цит. по Егорову и др., 1997).

Указанные факты и представления целесообразно рассматривать совместно с данными о зависимости структуры ядерного скелета от состояния цитоске-лета. Как известно, целостному цитоскелету непролиферирующей (дифференцирующейся) клетки соответствует слабо выраженная, фрагментированная скелетная структура ядра; напротив, с дезорганизованным цитоскелетом ростстимулированной клетки коррелирует высокоразвитый ядерный матрикс, что считается необходимым для упорядоченного прикрепления к нему ДНК и организованного протекания репликативного синтеза ДНК. Данные положения рассматриваются нами как весьма принципиальные. Действительно, организованное расположение микротрубочек и микрофибрилл в цитоплазме изменяет их взаимодействие с геномом так, что клетка теряет способность к разм-ножению (Епифанова и др., 1983). Разрушение же даже небольшой доли клеточных микротрубочек может инициировать синтез ДНК (Bershadsky et al., 1995). Неслучайной представляется и корреляция: белок статмин (метабластин, онкопротеин 18), препятствующий встраиванию тубулина в микротрубочки и вызывающий их разборку, найден во всех размножающихся клетках позвоночных (см. Надеждина, Зиновкина, 1999 и цитируемые ими работы).

Определённое отношение к взаимовлиянию цито- и ядерного скелета имеют, на наш взгляд, периодические АТР-зависимые сокращения как элементов цитоскелета, прежде всего микротрубочек, так и определённых структур ядра – комплекса кислого негистонового белка с гистоном, а также обнаруженных в ядре актомиозиновых образований. Представлено, в частности, доказательство наличия миозина I в ядре различных тканей и клеточных линий (Nowak et al., 1997), а ранее сообщалось, что ряд сократительных белков (миозин, тропонин, тропомиозин) принадлежат к ДНК-связывающим белкам (Corces, Avila, 1978).

Названные АТР-зависимые сокращения, вероятно, ограничивают «заякоривание» теломер и их внутрихромосомных последовательностей к ядерной оболочке и фибриллярно-гранулярной сети внутри ядра (подробнее об этом см. п.3.6.5). В нормальной же ростстимулированной клетке, в связи с дефицитом АТР и отсутствием со стороны дестабилизированного цитоскелета «диспергирующих» управляющих воздействий, теломеры непосредственно или через теломеросвязывающие белки прикрепляются к ядерной оболочке и ядерному матриксу, создавая тем самым условия для устойчивого протекания ферментативно регулируемого синтеза ДНК. После определённого числа клеточных удвоений без компенсации указанных повторов длина теломер может уменьшиться до критической величины. Такие теломеры, как отмечалось выше, не способны уже прикрепляться к ядерным мембране и матриксу и, следовательно, создать названные нами условия для репликативного синтеза ДНК, если даже устанавливается в клетке необходимый для окислительного митогенеза уровень дисбаланса Δ_П (ПО – АО).

Несколько иная ситуация складывается при исправном функционировании теломеразного звена. Восстановление длины теломер позволяет им связываться с матриксом и мембраной ядра, что, в свою очередь, необходимо для осуществления репликативного синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы, в том числе и синтеза теломерных повторов при участии теломеразы. Следовательно, в этом случае проявляется действие замкнутой самоподдерживающейся системы, в которой условия для удлинения теломер в каждом митозе и заякоривания их взаимно обеспечиваются. Подобный режим, по всей видимости, реализуется в иммортализованных клетках. Здесь, однако, неясным остаётся механизм реактивации теломеразного гена (см. ниже).

Как представляется нам, указанные события в стареющей клетке или, во всяком случае, некоторые из них не могут происходить вне прямой или косвенной связи с постепенно нарастающим в ней дисбалансом Δ (ПО – АО). Даже относительно «мягкий» ещё окислительный стресс при старении клетки может затрагивать в той или иной степени многие внутриклеточные структуры и процессы, выполняя в основном дестабилизирующую, а в некоторых случаях и регуляторную роль. Так, окислительное изменение яДНК, обусловленное именно внутриклеточными факторами, происходит постоянно и с довольно высокой скоростью, что не может не вести к старению клетки (Ames, Shigenaga, 1992, 1993; Пескин, 1996, 1997). В указанном плане не составляют, по-видимому, исключение структуры и процессы, определяющие механизм теломерного старения. К тому же, по мнению некоторых исследователей (Блэкберн, 1997), именно изменённая теломерная ДНК, а не росто её укорочение, ведёт к блокированию деления ядра.

В связи со сказанным интересны данные Кирка и соавт. (Kirk et al., 1997) о том, что мутация теломеразной матрицы в клетках Tetrahymena thermophila резко замедляет или полностью блокирует деление ядра вследствие неспособности хромосом к расхождению в анафазе митоза. Одним из возможных факторов, прямо или косвенно причастных к образованию мутантных по теломерам клеток с дефектом в расхождении хромосом, может быть избыточный уровень АФК, которые, как отмечалось выше, способны к окислительному изменению и повреждению яДНК (см. Пескин, 1996). Можно предположить, что оксидативно-зависимые перестройки ядерных структур, включая теломерные участки ДНК, составляют существенную часть из тех, которые вообще происходят после начала старения клеток, в том числе и в связи с изменением спектра действующих генов (Meyyappan et al., 1995; Спитковский, 1997).

Исходную материальную основу для окислительной модификации яДНК и белков составляет нарастание продукции АФК с возрастом, которое определя-ется главным образом дефектами в митохондриях, в том числе повреждением мтДНК. При этом в митохондриальной системе создаются замкнутые контуры с положительной обратной связью по производству О . В результате концентрация О и других производных от него АФК может оказаться достаточной для изменения структуры и функции яДНК, «хотя она и расположена гораздо дальше, чем мтДНК, от генерирующей О внутренней мембраны митохондрии» (Papa, Skulachev, 1997). Мишенью АФК становятся и белки (см. выше) окислительная денатурация которых при старении должна усугубляться, так как теперь она не компенсируется соответствующей индукцией белков теплового шока, выполняющих функцию белков-ремонтников (Скулачев, 1997) 1997).

Окислительное действие на ядерные структуры оказывают также присутст-вующие в мембране ядра О -продуцирующие редокс-цепи. Повреждающий и (или) перестроечный эффект АФК ядерного происхождения должен быть достаточно высоким, так как мишени здесь расположены в непосредственной близости от места их генерации (Пескин, 1996). Кстати, участие различных АФК в ядерных процессах косвенно подтверждается наличием в ядре клеток специфических форм SOD (предположительно, Мn-SOD), каталазы и GPX. Последние обнаружены, в частности, в ядрах клеток коры головного мозга крысы, где они ассоциированы преимущественно с транскрипционно-активной фракцией хроматина (Protas, 1996). В ядре, как и во всех других клеточных структурах, присутствует также один из наиболее мощных эндогенных анти-оксидантов – мелатонин (см. Малиновская, 1998).

1.4.4. Приведённые выше достаточно весомые аргументы и факты позво-ляют допустить существование путей укорочения теломер при старении клеток, так или иначе связанных с установлением в них состояния свободнорадикаль-ной пероксидации. В самом деле, от уровня свободных радикалов в культуре зависит и скорость сокращения длины теломер (Von Zglincki et al., 1995). А в обзорной работе «Роль свободных радикалов, теломер и теломеразы в старении и канцерогенезе» (авторы La Torre et al., 1997) особое внимание уделено исследованиям, в которых старение клеток объясняется суммой молекулярных повреждений ДНК и потерей теломер под влиянием свободных радикалов. Сам факт укорочения теломер чётко коррелирует с лимитом Хейфлика (Хейфлик, 1997), причём, по мнению Голубева (1996а), просматривается некая фундаментальная связь между лимитом Хейфлика, скоростью старения и канцерогенезом, а общим фактором для всех них могут быть свободные радикалы О₂. Последние способны индуцировать путём активации факторов транскрипции многие белки, среди которых, например, CIP – ингибитор циклинзависимых протеинкиназ, один из маркёров старения (Russo et al., 1995). Не исключено, что механизм АФК-зависимой индукции синтеза распространяется и на белки, способные подавлять активность теломеразы как непосредственно, так и косвенно путём ингибирования определённых эндогенных протеинкиназ. Нап-ример, в числе первых указывается протеинфосфатаза 2А (Li He et al., 1997), а в качестве вторых – ингибиторы протеинкиназы С (Ku et al., 1998).

Можно думать также, что уже в условиях возникающего при старении умеренного окислительного стресса ряд ферментов, в том числе теломераза, попросту инактивируется по одному из указанных выше механизмов (окисление SH-групп, образование нуклеотид-белковых и S-S сшивок в теломеразе как рибонуклеопротеидном комплексе и др.). В итоге не происходит восстановления утрачиваемого в каждом митозе фрагмента теломерной ДНК. Возможно, правда, просто отключение теломеразного гена по заданной онтогенетической программе функционирования генома, осуществляющей на определённых этапах развития переключение экспрессии соответствующих генов, транскриптонов и даже целых подсистем генома (Лю, Ефимов, 1978; Лю, Саприн, 1980). В реализации этой программы могут участвовать и АФК, проявляя свои регуляторные, а не только деструктивные, как принято считать, свойства (Пескин, 1997). В некоторых случаях роль АФК может казаться противоречивой. Например, при концентрациях, соответствующих пролиферативному диапазону изменения Δ (ПО – АО), АФК не смогут сполна проявить свои обычные позитивные свойства в окислительном митогенезе, если теломеры укорочены и не прикрепляются к ядерным матриксу и мембране, т.е. если не созданы условия для репликативного синтеза ДНК.

Заслуживает внимания обсуждающийся в работах Оловникова (1996) и Голубева (1996а) механизм прямого участия АФК в укорочении теломер. Поддерживается, в частности, точка зрения о том, что АФК вызывают в геноме многочисленные однонитевые разрывы (ники), в том числе и на теломерной ДНК. Эти разрывы репарируются везде, но теломерная ДНК, являясь нетранскрибируемой, репарируется хуже или вовсе не подвергается ей. Из-за этого концы нитей ДНК при репликации просто отпадают по местам разрывов (Von Zglinicki et al., 1995). Продолжая исследование, эта же авторская группа (Saretzki et al., 1999) представила следующие данные. В условиях слабого окислительного стресса теломеры человека быстрее накапливают однонитевые пов-реждения, чем промежуточные повторяющиеся участки. Индукция же окислительным стрессом указанных повреждений в теломерах фибробластов MRC-5 и клетках глиобластомы U87 сопровождается усилением экспрессии р53 и р21 и задержкой клеточного цикла. Такая ответная реакция была смоделирована и путём обработки клеток короткими однонитевыми G-богатыми фрагментами теломерной ДНК. Эти и некоторые другие результаты данного исследования означали, что задержка клеточного цикла зависима от р53 и индуцируется образованием G-богатых однонитевых фрагментов при укорачивании теломер. Причастность окислительного стресса к повреждению и укорочению теломер в данном случае очевидна.

Ускоренное укорочение теломер при воздействии окислительного стресса получило подтверждение и некоторую конкретизацию механизма ещё в одной работе (Oikawa, Kawanishi, 1999). Совместная обработка пероксидом водорода и Cu(II) приводила к повреждению ДНК в сайте 5′-GGG-3′ теломерной пос-ледовательности и одновременно к более эффективному образованию в ней 8-оксо-7,8-дигидро-2′-дезоксигуанозина. А при воздействии NO + О₂ вызывало замену оснований в той же последовательности теломера. По этим фактам авторы данной работы заключили, что сайт-специфические повреждения пос-ледовательности GGG в теломерной ДНК, вызванные окислительным стрессом, играют важную роль в увеличении скорости укорочения теломер в процессе старения.

Немаловажно, что данный альтернативный, АФК-зависимый механизм объясняет резкие укорочения теломер, которые более соответствуют случайным событиям и в принципе невозможны, если бы действовал только обычный, «типовой» механизм постепенного сокращения длины теломерной ДНК. В этом плане вероятность АФК-индуцируемого укорочения теломер, как справедливо полагает Голубев, «тем больше, чем длиннее КРФ (концевые рестрикционные фрагменты, содержащие теломерные повторы и часть предтеломерной ДНК)», так как вероятность указанных случайных событий на длинных КРФ соответственно возрастает. Если короткие теломеры на концах деконденсированных хромосом есть показатель ограничения их связи с матриксом, то внутрихромосомные последовательности теломерной ДНК – потенциальные и повышенной вероятности места разрывов, в том числе АФК-зависимых, к которым, как отмечалось выше (см. Спитковский, 1997), они чувствительны. Интенсивность названных процессов в стареющих клетках должна, очевидно, повышаться по мере возрастания дисбаланса Δ (ПО – АО) в них, отражающего, по существу, реальный уровень внутриклеточных АФК.

Существенным аргументом, хотя и косвенным, в пользу участия АФК в укорочении теломер представляется принципиально важное, на наш взгляд, наблюдение о скорости уменьшения размера теломерных повторов в лейкоцитах периферической крови у лиц разного возраста (Frenck et al., 1998). Оказалось, что скорость потери теломер максимальна у детей в возрасте до 4 лет (более 1 т.п.н./год), затем эта скорость выходит на плато и вновь возрастает только в пожилом возрасте (более 40 лет). Если рассматривать эти данные с позиций первых трех этапов возрастного изменения дисбаланса Δ (ПО – АО), условно показанного на рис. 7 (см. п.1.6.1), то высокие скорости утраты теломер приходятся как раз на этапы I и III, где постулируются повышенные уровни АФК и реальная возможность негативного воздействия их на некоторые внутриклеточные процессы, в том числе на формирование длины теломер.

Что касается данных о возрастании по мере укорочения теломер в нормальных клетках молекулярного беспорядка, рассматриваемого как эквивалент возрастных изменений (Хейфлик, 1997), то причины такой корреляции неясны. Косвенно она, возможно, и определяется невозобновляемой потерей части теломерной ДНК, затруднениями в заякоривании теломер, но более правдоподобным представляется другое объяснение. Оно исходит опять-таки из факта нарастания в стареющей клетке дисбаланса Δ (ПО – АО), индуцирования им окислительной модификации различных биомолекул, дестабилизации скоординированных в норме синтетических и регуляторных процессов одновременно и независимо от изменения длины теломер. В этой связи могут быть поняты и факты старения клеток без укорочения теломер (Mori et al., 1999 и др.) и, наоборот, отсутствия феномена ускоренного старения у мышей разного возраста с нокаутом гена теломеразы (Rudloph et al., 1999) или долгожительства смертных (незлокачественных) В-лимфобластоидных клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр и сохраняющих постоянную длину теломер без учас-тия теломеразы (Sugimoto et al., 1999). Такие данные, по мнению самого автора теломерной гипотезы (Olovnikov, 2000), требуют создания принципиально новой теории клеточного старения, включающей в себя теломерную модель лишь как особый случай.

В ряде работ теломерная гипотеза увязывается с возможной ролью в активации старения белка р53 (см. обзор: Дункан, Реддел, 1997) – ядерного фос-фопротеина, подавляющего пролиферацию клеток и известного как продукт соответствующего гена-супрессора опухолей. По мере приближения клеток к старению ДНК-связывающая способность и транскрипционная активация белка р53 действительно каким-то образом повышаются (Bond et al., 1996 и др.). Считают, что механизм этого повышения и каскад процессов старения в целом запускаются в ответ на критическое укорочение теломер (Wynford-Thomas, 1996; Вазири, 1997). Более существенно другое наблюдение, выявленное при исследовании стареющих фибробластов человека (Vaziri et al., 1997): ускорен-ная потеря теломер, активация р53 и преждевременное старение клеток ассоци-ированы с гипероксией. Полагают, что в данном случае р53 претерпевает пост-трансляционную активацию, вызываемую повреждением ДНК и укорочением теломер при старении до критических размеров. В большинстве же опухолей человека эти эффекты просто отсутствуют: предположительно из-за мутации или делеции происходит потеря функции р53 (Вазири, 1997). В этой связи могут быть интересны данные об индукции мутации р53 радикалами О₂ (Hussain et al., 1994), подтверждённые и другими работами. Показано, в частности, что индукция мутаций в генах р53 и ras под действием афлатоксина В связана с образованием АФК и окислительным повреждением ДНК (Shen, Ong, 1996).

Рассмотренный выше теломерный механизм относится к стареющим и опухолевым клеткам, которые, по нашим представлениям, находятся в состо-янии непрерывно поддерживаемого кислородно-перекисного стресса на уровне, соответствующим дисбалансам Δ_С (ПО – АО) и Δ_К (ПО – АО) в них. Структурно-функциональные особенности указанных клеток, скорее всего, и опре-деляются перманентным действием этого внутриклеточного возмущающего фактора. Данного патологического режима нет при нормальной клеточной специализации, хотя она и имеет со старением некоторые общие проявления, наиболее очевидная из которых – полная или частичная утеря способности к пролиферации при действии внеклеточных стимулирующих сигналов. Эта осо-бенность определяется, очевидно, какими-то существенными моментами в механизме, связывающим процессы дифференцировки и пролиферации.

В норме, как известно, дифференцировка происходит по заранее предопределённой логике переключения генов и транскриптонов, причём поэтапное зак-репление появляющихся признаков специализации осуществляется при каждом клеточном цикле, перемежающимся с последовательными состояниями дифференцировки. По мере нарастания степени дифференцировки и приближения к её терминальной части пролиферативная составляющая процессов постепенно затухает. В периодах S и М клеточного цикла, как уже отмечалось (см. п.1.1.1), потребление О₂ клеткой минимально, а внутриклеточные уровни рО₂ и свободнорадикальных оксигеназных процессов в этом состоянии соответственно должны быть повышены и, следовательно, более эффективны в своем регулирующем и (или) модифицирующем действии, чем в момент самой дифференцировки. Из сказанного следует, что дифференцирующиеся клетки переходят в состояние умеренного пероксидативного стресса лишь на относительно короткое время, достаточное, однако, чтобы активировать окислительный митогенез (см. п.1.1.2; 3.6.1 – 3.6.4). Другими словами, в специализирующихся клетках отсутствует перманентное кислородно-перекисное напряжение, а вре-менно возникающий в них дисбаланс Δ_П (ПО – АО) способствует, в основном, реализации пролиферативной стадии дифференцировочного процесса.

С изложенных позиций признаки периодичности и непрерывности пероксидативного стресса представляются нам достаточно принципиальными и, возможно, даже ключевыми для понимания некоторых противоположных эф-фектов, индуцируемых АФК (например, стимуляции дифференцировки, по одним данным, и усиления пролиферации, по другим – см. Голубев, 1996а; Пескин, 1997). Двойственность эффектов АФК определяется, вероятно, их ти-пом и соотношением, дозой и продолжительностью воздействия, при определённых сочетаниях которых могут создаваться необходимые условия как для активации окислительного митогенеза, так и для укорочения теломер, остановки деления и стимуляции дифференцировки.

Обсуждая изменения в хроматине стареющих клеток, естественно затронуть и вопрос о полиплоидизации ядер. Этот феномен, например, в печёночных клетках считают характерной особенностью процесса их старения и поэтому возможным путём оценки уровня полиплоидизации ядер судить о степени старения организма, модулируемого различными воздействиями. Для подтверждения этого положения авторы исследования (Мозжухина и др., 1997) подвергали 6-месячных крыс однократному рентгеновскому облучению в дозе 2Гр, которое вызывало структурно-функциональные изменения хроматина ядер гепатоцитов, сходные с таковыми у интактных старых животных. Через 30 сут после облучения значимо увеличивался уровень полиплоидизации всей популяции ядер. То же самое происходило и при частичной гепатэктомии, стимулировавшей клеточную пролиферацию. В обеих моделях старение клеток печени «ускорялось», и полиплоидизация их ядер признана как критерий старения, смоделированного в данных случаях искусственно. О накоплении полиплоид- ных эндотелиоцитов в нормальных сосудах в ходе онтогенеза сообщили также Ильинская и соавт. (1999). По их данным, частота встречаемости таких эндо-телиоцитов достоверно коррелирует с возрастом человека. К 35-40 годам эта частота близка к стационарному уровню, составляющему приблизительно 30% от числа всех клеток. Ярко выраженная полиплоидизация эндотелиоцитов предопределяется, вероятно, самим функциональным назначением крове-носных сосудов, которые более, чем другие органы и ткани, подвергаются систематическому «окислительному давлению».

Одной из причин патологических митозов при старении (отчасти, как и при канцерогенезе – см. п.2.3.5) предположительно может быть повреждение в соответствующих клетках тиолового механизма сборки митотического аппарата, вызванное пероксидативными условиями в них. АФК, липидные радикалы и продукты ПОЛ могут, по-видимому, непосредственно воздействовать на тиоловые группы белков и на указанный механизм, нарушая цитоскелет, сборку белков митотического аппарата в ориентированную систему веретена деления, а также деление центриолей и расхождение хромосом. В определённой степени эти нарушения могут быть связаны и с дефицитом АТР и сАМР в стареющих клетках и соответственно ослаблением зависимых от них процессов полимеризации тубулина и формирования микротрубочек веретена деления.

Наконец отметим, что комплексный и системный подходы к анализу изложенных выше материалов о возрастных изменениях в клетке представляются нам целесообразными и перспективными для понимания многих ещё неясных и достаточно существенных фактов, а также механизма старения клетки в целом. Главные же наши выводы сводятся к следующему: 1) подтверждаются известные данные о том, что прямое отношение к старению клетки имеют возраст-зависимые реорганизации как мтДНК, так и яДНК (Осивец, Хаманн, 1997; Скулачев, 1997); 2) некоторые положения теломерной теории старения и иммортализации соматических клеток могут быть в принципе осмыслены и (или) обоснованы с позиций кислородно-перекисной концепции старения и канцерогенеза; 3) при таком подходе расширяются возможности для более глубокого и полного распознавания механизмов старения и иммортализации клеток, поскольку учитывается и множество других, казалось бы, не связанных между собой внутриклеточных проявлений, индуцируемых в стареющих и опу-холевых клетках повышенным кислородно-перекисным напряжением.

1.4.5. Внутриклеточная гипероксия как результат первичного процесса старения митохондрий становится фактором поражения не только всех субклеточных структур, но и , «прорываясь» наружу, внеклеточных образований. При этом, естественно, вне токсического воздействия гипероксии не может оставаться и плазматическая мембрана. Наблюдаемая при старении активация ПОЛ, особенно в условиях ослабления антиоксидантной защиты, является универсальным средством модификации и повреждения клеточной мембраны, которая считается важным компонентом первичного процесса старения (Надь, 1982). Частично вопрос об изменениях в плазматической мембране при старении клеток уже затрагивался нами в п. 1.2 и 1.3. Здесь же целесообразно продолжить его рассмотрение.

Судя по множеству публикаций, «мембранная» тема и, в частности, мембранная гипотеза старения (Zs.-Nagy, 1991) – одна из наиболее привлекательных, причём разные исследователи высказывают, по существу, сходные мнения. В большинстве случаев отмечаются дестабилизация плазматической мембраны продуктами ПОЛ, в избытке образующихся при старении и многих возрастных заболеваниях, и связанные с ней нарушения состояния и функций мембраносвязанных ферментов, ионных каналов, рецепторов и соответствующих механизмов регуляции (Лабори, 1970; Фролькис, 1982; Эмануэль, 1982 и др.). Полагают, что вообще «модификация структуры плазматической мембраны – одна из наиболее вероятных механизмов нарушения регуляции тканевого метаболизма при старении» (Гацко и др., 1988). Считают также возможным возрастную модификацию структурной организации мембран, обусловленную уменьшением степени ненасыщенности жирных кислот, увеличением содержания лизоформ фосфолипидов, рассматривать как общебиологическую закономерность стареющих организмов (Конопля и др., 1991).

Заметим здесь, что с указанными представлениями согласны не все исследователи. В частности, существует мнение о том, что снижение активности внутриклеточных ферментов с возрастом не является общей закономерностью. В связи с этим ставится под сомнение мембранная гипотеза старения (Kitani, 1993). Расходятся мнения и о сдвигах в плазматической мембране. Оно касается в основном последовательности возникающих изменений. По одним сведениям, первична дестабилизация структуры мембраны, приводящая к усилению ПОЛ как вторичного явления, а по другим – перестройка физической структуры мембраны начинается с окисления ненасыщенных жирных кислот и выхода их из фосфолипидного бислоя (см. Конопля и др., 1991). С первым представлением согласуются данные о том, что любая пертурбация плазматической мембраны, в том числе воздействия, разрыхляющие структуру липидной матрицы (например, взаимодействия с различными лигандами), активируют ПОЛ (Обухова, 1986). Эта точка зрения привлекательна и с позиций первичности старения в клетках митохондрий. Последние среди внутриклеточных органелл обладают наибольшей ёмкостью по отношению к Са²⁺ (Левицкий, 1990). При окислительном повреждении митохондрии высвобождают запасённые в них ионы Са²⁺, а также образующиеся АФК, свободные радикалы и продукты пероксидации, которые, как известно (Дубинина, 1989; Садовникова, 1989; Byczkowski, Channel, 1996; Sakamoto et al., 1999), являются активаторами фосфолипаз, входя-щих в состав всех мембран. Возникает ситуация, которая способствует, очевид-но, упомянутому выше разрыхлению липидной матрицы, включая изменения в микроокружении рецепторов, ферментов и других функциональных единиц мембраны. Это обстоятельство совместно с гипероксическими условиями зна-чительно облегчает последующую интенсификацию ПОЛ в плазматической мембране стареющих клеток.

Структурная реорганизация плазматической мембраны, как отмечалось выше, затрагивает прежде всего липидный компонент, который участвует в каталитической, рецепторной и адаптационной функциях. Одним из важных последствий этого является снижение чувствительности клеток-мишеней к действию различных белково-пептидных гормонов (инсулина, глюкагона, соматотропина, вазопрессина и др.) и соответственно изменение регуляторных эффектов этих гормонов, что считается характерной особенностью процесса старения организма. Снижается также регуляторное влияние стероидных гор-монов. По указанным причинам, вообще, нарушение механизмов нейрогор-мональной регуляции метаболизма и функции клеток, органов и систем при старении высоковероятно (Конопля и др., 1991). По мере старения должна снижаться чувствительность клеток и к другим белково-пептидным лигандам, в частности, к различным негормональным факторам роста.

Действительно, известны работы, в которых выявлено прогрессивное снижение чувствительности клеток к таким факторам роста с увеличением возраста как животного донора клеток, так и возраста культуры клеток (см. Бгагосклонный, 1986). На причастность к подобному эффекту нарушений в фосфолипидном бислое мембран, о которых говорилось выше, указывает и такой эксперимент, имеющий к старению лишь косвенное отношение. С целью изучения роли фосфолипидов в связывающей способности рецепторов вазоак-тивных пептидов обрабатывали фосфолипазами А₂, С и Д мембраны эпители-альных клеток кишечника крысы. Наиболее активной из этих ферментов была фосфолипаза А₂ в концентрации 0,01-1,0 мкг/мл в течение 3-5 мин инкубации. Исходя из характера действия данных модификаторов бислоя, авторы (Sarrieau et al., 1985) сделали вывод: для связывания вазоактивных пептидов с мембраной существенны как гидрофобные, так и гидрофильные группы фосфолипидов, обеспечивающие электростатическое взаимодействие между мембранным рецептором и белковым лигандом. Невыясненным, правда, остался вопрос о том, вызывают ли фосфолипазы указанный эффект, избирательно затрагивая окружение молекул рецептора или неспецифически модифицируя более обширные области бислоя. Таким образом, вследствие того, что в процессе старения количественно и качественно изменяется ответная реакция клеток на гормональные и другие регуляторные воздействия, соответственно изменяется и характер формирования внутриклеточного гомеостаза, а это неизбежно приводит к рассогласованию метаболических процессов, снижению адаптивных возможностей организма.

Кроме нарушений в функционировании локализованного в клеточной мем-бране рецепторного аппарата, происходит искажение функции многих мембраносвязанных и липидозависимых ферментных систем. В комплексе все эти отклонения от нормы приводят, естественно, к тому, что нарушаются механизмы формирования первичных сигналов, их преобразования и передачи с поверхности клетки к её внутренним структурам – «потребителям» этих сигналов. В результате реализуются дефектные физико-химические процессы (энергетические, синтетические, информационно-регуляторные и др.), причастные к нормальным возрастным изменениям и возрастным патологиям. Некоторые вопросы из указанного комплекса нарушений обсуждаются по ходу изложения материала в последующих разделах данной монографии.

Наряду с внутриклеточными структурами и плазматической мембраной старение затрагивает и внеклеточный матрикс, основная функция которого – интеграция клеток и тканей в организме. Компонентами этого матрикса являются коллаген, ламинин, эластин, фибронектин и др. Возрастные изменения обмена компонентов внеклеточного матрикса включают в себя ускорение распада эластина, ослабление связи фибронектина с клетками и ряд других гистологических изменений, предрасполагающих к «возрастным» болезням, в том числе возникновению неоплазм, инвазивному их росту и метастазированию (Labat-Robert, Robert, 1988; см. также п.2.4). Расстройство внеклеточного матрикса и межклеточных контактов может быть следствием ослабления трансмембранной связи поверхностных структур стареющей клетки с её изме-нённым цитоскелетом. Кроме того, ПОЛ, развивающееся в плазматической мембране такой клетки, затрагивает, по-видимому, и липиды поверхностных образований, в частности щелевых контактов, где они играют важную струк-турно-функциональную роль (Malewicz et al., 1990). Дефекты же в контактах нарушают нормальные межклеточный транспорт и интегративные межклеточ-ные взаимодействия. Указанным изменениям внклеточного матрикса должны способствовать также снижение градиента О₂ в околокапиллярном пространстве и соответственно некоторое возрастание напряжения О₂ в ткани при слабой утилизации его клетками (Эйдус, Корыстов, 1984), в том числе стареющими.