4.2. Основные положения кислородно-перекисной

модели «спонтанной» малигнизации

При разработке новой концепции канцерогенеза необходимо учитывать все материалы, касающиеся постепенного изменения характеристик и малигни-зации нормальных клеток в условиях in vitro, поскольку в них содержится достаточно серьёзная информация. Наша глобальная задача – обосновать, по возможности, представление, согласно которому в основе всех видов кан-церогенеза, включая и «спонтанную» трансформацию клеток вне организма, находится какой-то единый механизм, и таковым, скорее всего, является кис-лородно-перекисный.

4.2.1. Изучение известных на сегодня способов культивирования в моно-слое показало, что все они проводятся при атмосферном давлении и, следо-вательно, при рО₂, значительно превосходящим значения, которые имеют место в организме в норме. Условия культивирования таковы, что через тонкий слой синтетической питательной среды к однослойным клеткам в сосуде свободно диффундируют молекулы О₂ и внутри них устанавливается высокое рО₂, невозможное in vivo или, во всяком случае, превышающее допустимые зна-чения. Обычно клетка находится под слоем инкубационной жидкости, рО₂ в которой близко к рО₂ воздуха.

С точки зрения развиваемой нами концепции канцерогенеза, постулирую-щей необходимость создания в клетке состояния устойчивой гипероксии и избыточной пероксидации для опухолевой трансформации и её поддержания (см. главу 2), трудно представить более подходящие естественные бластомо-генные условия, чем создаваемые в монослойных культурах. По-видимому, сама гипероксическая обстановка в них «подготавливает» клетки культуры к спонтанной трансформации и приближает их к этому событию, поскольку скорость образования активных форм О₂ и, следовательно, интенсификации ПОЛ мембран находятся в прямой зависимости от рО₂ (Fridovich, 1975; Turrens et al., 1982). Именно такая подготовленность, на наш взгляд, может лежать в основе феномена высокой чувствительности культуральных клеток к действию различных химических канцерогенов. Следствием этого являются быстрота и массовость (высокая частота) злокачественного превращения клеток в монослое под влиянием указанных канцерогенов (Гершун и др., 1982). Кроме того, высокий процент малигнизированных клеток обусловлен здесь, по-видимому, и тем, что в условиях культуры не проявляется мобилизация антиоксидантной системы защиты, которая в целом организме играет, как известно, важную роль в подавлении предраковых очагов.

Существенно также, что к повышению в клетках культуры уровня дисба-ланса ∆ (ПО – АО) до соответствующего «канцерогенному» диапазону ∆_К (ПО – АО) может способствовать и тепло, т. е. постоянно действующий фактор окружающей среды. Как было показано с помощью высокочувствительного метода (описание его приводят авторы Брусков и др., 2001), в результате тепловой активации растворённого в воде атмосферного О₂ протекает после-довательность реакций

О₂ → ¹О₂ → О → НО₂˙ → Н₂О₂ → ОН˙.

Образующиеся при таком содействии тепла АФК причастны, очевидно, к созданию необходимых для трансформации клеток и устойчивого её поддер-жания пероксигеназных условий. Тепловой фактор выступает здесь как, своего рода, «катализатор» – активатор и усилитель потенциальных окислительных возможностей гипероксии. В условиях же гипоксии тепловая активация О₂ будет, естественно выраженной слабо.

Перечисленные в п. 4.1 изменения в малигнизируемых клетках объяснены нами в главе 2 с позиций общей кислородно-перекисной концепции онкогенеза. Канцерогенные условия гипероксии и пероксидации внутри трансформируемой клетки представлялись там как вторичный эффект, как следствие предвари-тельного первичного нарушения канцерогенными факторами антиоксидантной системы защиты клетки и, прежде всего, её антикислородной ступени (мито-хондриального дыхания). Однако in vitro те же изменения в клетке предстают теперь как первичный эффект естественно существующей, постоянно и непосредственно действующей гипероксии. Следовательно, в этом случае нет необходимости в искусственном создании гипероксии путём предварительного воздействия истинными канцерогенными факторами, которые обязательны для инициации большинства видов неопластической трансформации, но не сущес-твенны для спонтанной малигнизации. В этом и заключается особенность бесканцерогенного механизма перерождения клеток в культуре.

Условия культивирования и главным образом обусловливаемые ими гипер-оксия и пероксигенация сначала оказывают угнетающее действие на субкле-точные элементы, на физиологические и метаболические процессы, в резуль-тате чего начальный период жизни этих культур характеризуется постепенным затуханием энергии роста. Так, при плотности посева от 0,005 до 2·10⁴ кл/см² рост диплоидных фибробластов человека прогрессивно ингибировался при рО₂ > 140 мм рт. ст. Полагают, что О₂ действует на клетки непосредственно, а не путём разрушения каких-то компонентов среды (Arthur et al., 1984). К прек-ращению роста тех же фибробластов в культуре в конце периода их пролифе-ративной жизни может иметь отношение и опухолесупрессорный белок р53.

Косвенно это доказывается разными способами, в частности, инактивацией р53 в стареющих клетках путём микроинъекции в них моноклональных антител к р53. Эти антитела индуцируют вступление стареющих клеток в S-фазу и про-хождение всех других фаз клеточного цикла, что сопровождается реверсией к «молодому» морфологическому фенотипу клеток (Gire, Wynford-Thomas, 1998). Однако по истечении указанного, вероятно, адаптационного периода, в ходе которого происходит отбор наиболее приспособленных к гипероксии клеток, постепенно вступает в силу упомянутый выше кислородно-перекисный меха-низм канцерогенеза, который и приводит к спонтанной малигнизации. К тому же, в условиях длительной гипероксии и значительного избытка АФК могут мутироваться ген р53 (Hussain et al., 1994; Shen, Ong, 1996; Souichi et al., 2000) или посттрансляционно инактивироваться функции онкобелка р53 (Cobbs et al., 2001), что увеличивает вероятность перехода отдельных клеток культуры в состояние неконтролируемого роста. Эти обстоятельства позволяют понять тот факт, что трансформация клеток, за редким исключением, наступает лишь после длительного культивирования.

Характерный в рассматриваемом аспекте материал представлен в давней работе Мика и соавт. (Meek et al., 1980). В культуре клеток 15-17-суточных эмбрионов крысы снижение пролиферативной способности сохранялось до 9-го пассажа, причём методом замедленной микрокиносъёмки обнаружены увели-чение неделившейся фракции клеток и удлинение межмитотического периода. Примерно на 10-м пассаже произошла трансформацию в клеточную линию с неограниченным ростом, быстро повысились скорость пролиферации и доля клеток, включающих ³Н-тимидин. Однако они оставались диплоидными и не приобретали опухолеобразующую способность до 20-го пассажа.

Аналогичные данные изложены в другой работе (Kraemer et al., 1983), авторы которой наблюдали спонтанную опухолевую эволюцию в культуре кле-ток эмбрионов китайского хомячка в виде многоэтапной прогрессии фенотипа. Между 5-м и 12-м пассажами темп пролиферации клеток снижался, наступало старение их, и при малой плотности насыщения образовались регрессирующие колонии. После этого «кризиса» выявлялись быстро пролиферирующие клетки, образующие стабильные линии. Исследователи выделяют 4 стадии в возникно-вении опухолеобразующей способности: первая (1-12-й пассажи), когда клетки не обладают такой способностью и большинство из них стареет; вторая (13-29-й пассажи), когда клетки ещё не способны к опухолеобразованию, но могут неограниченно делиться in vitro; третья (30-50-й пассажи) – клетки образуют опухоли при введении в предварительно имплантированную желатиновую губку, успевшую к этому моменту васкуляризоваться; четвертая (более 50 пассажей) – клетки образуют опухоли при непосредственной имплантации.

Если в период упомянутой выше адаптации клеток изменить условия куль-тивирования путём перехода к искусственной газовой среде с низким рО₂, то угнетающее действие гипероксии на эти клетки, естественно, исчезнет или снизится. Действительно, количество выживаемых колоний кроветворных кле-ток мыши при рО₂ в газовой фазе 48 мм рт. ст. (вместо обычных 135 мм рт. ст. при культивировании) значительно увеличивается. В этих же условиях улучша-ется рост эмбриональных фибробластов мыши, причём в некоторых опытах прирост их был в 10 раз выше в сравнении с обычным культивированием при 18 % О₂ в воздухе (Bradley et al., 1978). При снижении содержания О₂ в среде до 1,6 или 12 % у диплоидных фибробластов IMR90 человека с различными исход-ными уровнями удвоения популяции увеличивается период пролиферативной жизнеспособности. Этот период при 1 % О₂ возрастает на 22 %, а возвращение культур из среды с 1 % О₂ в среду с 20 % О₂ быстро развивает их старение (Saito et al., 1995). Возрастание лимита Хейфлика при 1-3 % О₂ в газовой среде для культивирования и, напротив, снижение его в условиях оксистресса пока-зано и в ряде других работ (Chen et al., 1995; Von Zglinicki et al., 1995).

Из числа сходных публикаций последних лет можно отметить исследова-ния, проведённые на первичных культурах мезангиальных клеток почечных клубочков крысы. В условиях 28-часовой хронической гипоксии (3 % О₂) в этих клетках возрастало включение ³Н-тимидина, а через 72 ч увеличивалось число клеток по сравнению с культурами, растущими в условиях нормоксии. Интере-сен и другой факт: гипоксия вызывала транслокацию PKC из цитозоля в мемб-раны и активацию этого фермента, ингибитор же PKC предотвращал индуци-рованное гипоксией увеличение скорости пролиферации (Sahai et al., 1997). Более существенные результаты получены при культивировании мезенхимных стволовых клеток из костного мозга 6-12-недельных крыс F-344 в атмосфере 5 % О₂ + 5 % СО₂ + 90 % N₂ (опыт) и 95 % воздуха + 5 % СО₂ (контроль). В опытных культурах формировалось большее число колоний, клетки пролифери-ровали быстрее, а содержание ДНК в них было выше, чем в контроле. Клетки этих культур продуцировали больше костной ткани при пересадке их в порис-тых керамических носителях сингенным реципиентам. Кроме того, экспрессия маркёров остеогенной дифференцировки повышалась при замене атмосферы с высоким содержание О₂ на «опытную» и, наоборот, снижалась при обратной замене атмосферы культивирования. Итак, клетки in vitro действительно функ-ционируют оптимальнее в условиях пониженного содержания О₂, которые больше соответствуют устанавливающимся in vivo (Lennon et al., 2001).

Цитотоксическое действие гипероксических условий культивирования на клетки можно частично уменьшить путём стимуляции митохондриального дыхания и снижения тем самым внутриклеточного рО₂. Эта цель может быть достигнута, например, с помощью cAMP, который как раз и является одним из таких стимуляторов (см. п. 2.1.9). Если исходить из данного представления, то становятся понятными следующие результаты. Через 5 дней культивирования нейронов, изолированных из фрагментов среднего мозга 14-дневных эмбрионов крыс, выживало 90 % клеток в случае, когда в используемые для приготовления клеточной суспензии растворы добавляли 700 мкМ дибутирил-cAMP. В конт-роле же, без добавления cAMP, таковых было лишь 40 % (Branton et al., 1998).

Неадекватность внутриклеточной антиоксидантной системы гипероксичес-ким условиям жизни вне организма подсказывает исследователям и другие пути предотвращения быстрого старения и деградации культивируемых клеток, в частности адаптационный, за счёт приведения «материальной базы» антиокси-дантной системы в соответствие с возросшим уровнем рО₂. Поразительные в этом отношении факты приведены в работе Велка с соавт. (Valk et al., 1985). В результате постепенной адаптации к возрастающим концентрациям О₂ полу-чена линия клеток яичка китайского хомячка, устойчивая к высокому содер-жанию О₂ и способная пролиферировать при 99 % О₂ и 1 % СО₂. Контрольные клетки в таких условиях погибали. Адаптировавшиеся клетки отличались от исходных. Объём фракции митохондрий в них возрастал в 1,8 раза, причём увеличивались как количество митохондрий, так и их размеры. Объём фракции пероксисом увеличивался вдвое: в 1,9 раза возрастало их количество и в 1,2 раза они увеличивались в размере. Удельная активность Cu,Zn-SOD увеличи-валась в 2,5 раза, Mn-SOD – в 2,1 раза, каталазы – в 4 и GPX – в 1,9 раза. Кроме того, количество липидных капель в них было больше, а скорость роста клеток несколько снижена. Все эти существенные приспособительные изменения вполне объяснимы: увеличение «мощностей» митохондриального дыхания и пероксисомального окисления (одной из форм дыхания пропорционально нап-ряжению О₂ в клетке), означает усиление в составе антиоксидантной системы клетки антикислородной линии защиты и как следствие снижение внутрикле-точного рО₂; с повышением активности SODs, инактивирующих О , возраста-ет эффективность антирадикальной линии защиты; увеличение же активности каталазы и GPX, естественно, усиливает антиперекисную ступень защиты.

Указанная адаптация клеток к гипероксии и пероксидации, очевидно, дол-жна обеспечить высокую устойчивость их к токсическому действию О₂, АФК и перекисных продуктов, а также резистентность к малигнизации на последую-щих стадиях. Конкретный механизм такой адаптации неизвестен. Возможно, здесь для митохондрий действуют О₂-и АФК-зависимые механизмы регуляции количества дыхательных ферментов (Murphy et al., 1984; Suzuki H. et al., 1998), согласно которым при гипероксии их число должно постепенно нарастать. Представляется, что рассмотренный и другие подобные феномены связаны с амплификацией определённых генов ядра и митохондрий, причём в норме этот процесс индуцируется при установлении, по-видимому, лишь умеренных гипероксии и ПОЛ в достаточно узких пределах их изменения, но способен, судя по работе Велка и соавт. (см. выше), постепенно адаптироваться и нейтра-лизовать действие и более высоких, токсических уровней внутриклеточного рО₂ и пероксидации. Реализация сказанного наглядно демонстрируется фактом амплификации генов каталазы при хроническом воздействии (более 200 дней) на фибробласты китайского хомячка возрастающих концентраций О₂ или Н₂О₂. В результате такого воздействия получен резистентный к окислительному стрессу фенотип: клетки его обладали в 20-30 раз более высокой активностью каталазы, чем родительские, и в них найдено 4-6-кратное увеличение числа копий генов каталазы (Hunt et al., 1998).

Предполагаемая причинная связь между неадекватностью газовой среды и спонтанной малигнизацией в условиях культуры может быть проверена постановкой простых экспериментов. Из теории этого вопроса, в частности, следует, что культуры клеток и тканей, растущие при рО₂ не выше тех, которые характерны для соответствующих нормальных тканей внутри организма, не должны малигнизироваться. Действительно, 1-2 % содержание О₂ в газовой среде не индуцирует и не стимулирует спонтанное неопластическое превраще-ние клеток эмбриона генетически однородной высокораковой линии мышей C3Hf. Высокое же содержание О₂ (40 %) не предупреждало и не задерживало указанного превращения (Sanford, Parshad, 1968).

С этой же точки зрения, различные виды антиоксидантов также относятся к антиоксистрессорным и антитрансформирующим факторам. Так, воздействие витамином Е на культивируемые клетки микроглии коры головного мозга новорожденных крыс Wistar обеспечивало выживаемость их до 7 суток. А боль-шинство контрольных клеток (до 81,5 %) погибало к этому сроку, не выдер-живая определяемого условиями in vitro окислительного стресса (Heppner et al., 1998). Кстати, цитотоксическое действие данных условий можно усилить, если обеспечить клетки в достатке соответствующими субстратами, в частности PUFAs, «сжигание» которых будет усугублять в них токсическое пероксиге-назное состояние. Примером здесь мог бы служить тот факт, что длиноцепо-чечные n-3 и n-6 PUFAs (50 мкМ) подавляли рост и пролиферацию в монослое уроэпителиальных клеток, полученных из мочевого пузыря здорового человека (Diggle et al., 2000).

Развиваемые нами положения, несмотря на отсутствие сегодня более «тонких» доказательств, кажутся достаточно очевидными и поэтому должны быть приняты во внимание при разработке общего механизма неопластической трансформации клеток. Здесь же мы ограничимся пока «алгоритмом» возмож-ных различных эффектов, детерминируемых содержанием О₂ в культуральной среде (рис. 21).

4.2.2. Изложенным представлениям, казалось бы, противоречат данные упоминавшейся выше давней работы (см. Goldblatt, Cameron, 1953). Создавая кислородное ограничение, авторы её экспериментально вызывали раковое перерождение фибробластов сердца, выращиваемых в культуре ткани в течение 2,5 лет. Однако для правильной интерпретации полученных ими результатов необходимо учесть то существенное обстоятельство, что на протяжении ука-занного срока культуры находились в состоянии анаэробиоза не постоянно, а лишь периодически. В контрольной культуре, не подвергавшейся периоди-ческому лишению О₂, опухолевые клетки не возникали. На фоне этого различия аноксия, на первый взгляд, безоговорочно выступает здесь как главный фактор