1. Накопление активных радикальных центров в вакууме (при гипоксии)

ROO → RO˙ + OH˙ ; RH + RO˙ → R˙ + ROH; RH + OH˙ → R˙ + H₂O.

2. Развитие хемилюминесцентной реакции при последующем пуске воз-духа (о2)

O₂ + R˙ → ROO˙.

Аналогичное в принципе мнение высказано в работе, где рассматривалась роль свободных радикалов О₂ в патогенезе повреждения миокарда в постише-мическом периоде. Авторы её (Flaherty, Weisfeld, 1988) представили данные о «взрывном» возрастании уровня свободных радикалов уже в первые 30-60 сек реперфузии, об уменьшении скорости их образования и выраженности пов-реждения миокарда при применении различных антиоксидантов в период реперфузии.

Подробное обоснование тому, почему при гипоксии и последующей реоксигенации происходит усиленное образование АФК, представили также Осипов и соавт. (1990). Опираясь на известные факты того, что в гипокси-ческих клетках повышаются активность NADH-оксидазы, расщепление ATP с образованием ксантина и содержание Fe²⁺ в свободном и связанном виде, а ксантиндегидрогеназа превращается в ксантиноксидазу, они пришли к заклю-чению: при реперфузии усиливается образование О за счёт окисления NADH NADH-оксидазой и ксантина ксантиноксидазой. Из О образуется Н₂О₂ и затем в присутствии Fe²⁺ – радикалы ОН˙, активирующие ПОЛ. Даргел (Dargel, 1992), обобщив обширные сведения о ПОЛ как об одном из основных меха-низмов обратимого и необратимого повреждения клеток и тканей, сделал вывод о важном значении ПОЛ в патогенезе не только атеросклероза, воспаления, раковых заболеваний, но и при повреждении тканей ишемией-реперфузией и ксенобиотиками.

Эксперименты с чередованием ишемии разных органов с их реперфузией проводились и в последующие годы. Например, в опытах на крысах Wistar такая процедура по отношению к печени приводила к накоплению в её ткани соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и определяемых люми-несцентным методом свободных радикалов (Rhoden et al., 1996). В другой работе после устранения ишемии печени крыс, создававшейся пережатием соответствующих сосудов, увеличивался уровень мРНК гемоксигеназы, кото-рый достигал максимума через 4 ч с момента начала реперфузии, но затем возвращался к норме. Индукцию гемоксигеназы объясняют её протекторной ролью против деструктивных действий окислительного стресса (Ito et al., 1997). Действительно, как уже отмечалось в п. 1.5, гемоксигеназа, будучи стрессор-ным ферментом, защищает сосуды от окислительного повреждения, генерируя из гема вазодилятатор СО и обладающий антиоксидантной активностью билирубин (Deramaudt et al., 1998).

Частым объектом приложения процедур ишемии-реперфузии является и сердце. Анализ патофизиологических процессов при реперфузионных повреж-дениях этого органа проведён в работе (Koike, 1995), в которой, в частности, показаны появление свободных радикалов О₂, дисфункция ATPазы, активация фосфолипаз и протеаз – изменения, ведущие к необратимым последствиям в клетках и их гибели. В миокарде крысы после ишемии и последующей репер-фузии сердца снижалась активность SOD, повышалось ПОЛ и возникали значи-тельные нарушения в структуре митохондрий. Введение в/в галлоилгиперина, основного действующего вещества растения Pyrola calliantha, уменьшало все эти сдвиги, что связывается со способностью данного соединения быть ловуш-кой О , образующегося в миокарде при ишемии-реперфузии (Bian et al., 1998).

Достаточно убедительны также результаты опытов на трансгенных мышах, избыточно экспрессирующих Cu,Zn-SOD человека. Исследование повреждений в клетках миокарда, вызванных ишемией-реперфузией показало, что экспрессия SOD в миокарде трансгенных животных, в частности, в миоцитах и клетках эпителия, повышена в 10 раз по сравнению с контролем. Кроме того, методом ЭПР и спиновой ловушки установлен и другой факт: у контрольных мышей через 30 мин глобальной ишемии реперфузия вызывала взрывное образование О , тогда как у SOD-экспрессирующих трансгенных мышей такой взрыв почти отсутствовал, и с этим обстоятельством связывается уменьшение у них разме-ров участков инфаркта миокарда (Wang P. et al., 1998). Обсуждая недавно загадку реперфузии, Скулачев (1999) также поддержал АФК-зависимый меха-низм повреждений клеток при реоксигенации. Основным токсическим агентом является образующийся в реакции Фентона при участии Fe²⁺ радикал ОН˙. Именно эта реакция и развивается реоксигенацией.

Наконец, в числе экспериментов, подтверждающих изложенные выше пред-ставления, следует отметить следующие. Культуры опухолевых клеток RIF-1 и KHT находились в условиях аноксии (95 % N₂ и 5 % CO₂) в течение 2,5 ч несколько раз подряд с небольшими перерывами. Затем их пересеивали и определяли колониеобразующую способность. После суммарного 16,5 часового пребывания в указанных условиях и последующего возврата к аэробным клетки KHT и RIF-1 стали обладать более низкой колониеобразующей способностью, причём у первых этот эффект выражен значительнее, чем у вторых. Увеличение суммарного времени пребывания в условиях аноксии до 40 ч приводило к ещё большему снижению колониеобразующей способности, которое особенно выраженным было у клеток KHT (Kiani, Fenton, 1995). И в данном случае угнетающий эффект вызван, очевидно, резко проявляющейся гипероксией пос-ле предварительного выдерживания клеток в бескислородной среде. Не менее доказательны исследования на модели прекращения кровоснабжения опухоли путём пережатия питающего сосуда с последующей реперфузией (Parkins et al., 1996). Здесь показано, что цитотоксичность в опухоли достоверно усилива-ется во время реперфузии. Введение же SOD и каталазы до снятия зажима модулирует цитотоксичность после ишемии-реперфузии, приводя к снижению концентрации свободных радикалов О₂, образующихся при реперфузии и окис-лительном «взрыве» в нейтрофилах.

Справедливости ради следует отметить ещё работу, в которой в порядке дискуссии обсуждается альтернативный механизм возникновения гипероксии при реперфузии (Wolbrasht, Fridovich, 1989). Предположительно, гипероксия может быть обусловлена накоплением лактата в ишемизированной ткани и её закислением, что, вследствие эффекта Бора, должно приводить к возрастанию отдачи О₂ эритроцитами при реперфузии, увеличению поступления О₂ в ткани и активации образования свободных радикалов.

4.2.4. Условия длительного культивирования in vitro неблагоприятны в смысле окислительного стресса для большинства не только нормальных, но и опухолевых клеток. Последние сразу же после выделения их живого организма оказываются в непривычно высокой даже для них, уже гипероксичных, окисли-тельной среде. Эти условия действуют угнетающе на опухолевые клетки. Однако, при культивировании клеток со сниженной опухолегенностью в усло-виях низкого содержания О₂ в среде (5 % О₂) способность их к формированию новообразований и метастазов восстанавливается (Gordon, DeMarinis, 1990). Витамин Е поддерживает жизнеспособность различных культур злокачествен-ных клеток, а его производные с короткой боковой цепью даже значительно ингибируют рост указанных клеточных культур (Донченко и др., 1998). В другой работе проверялась гипотеза о том, что экспрессия мРНК bFGF, пред-положительно регулирующего ангиогенез, зависит от рО₂. С этой целью в атмосфере с 5 % СО₂ и варьирующим содержанием О₂ (2-50 %) выращивали клетки ретинобластомы человека Y79. При культивировании с 2 % О₂ экспрес-сия мРНК указанного фактора была в 40 раз выше, чем при выращивании в присутствии 50 % О₂. Подавление экспрессии мРНК bFGF в клетках Y79 при повышенном рО₂ явно свидетельствует о регуляции кислородом этого процесса (Higgins et al., 1991). Очевидно, клетки разных типов неоплазм и гетерогенные клетки каждого конкретного новообразования будут отличаться своей чувст-вительностью к кислородно-перекисной перегрузке в условиях in vitro и опре-делять тем самым разную степень своего окислительного повреждения.

Одним из вариантов адаптации неопластических клеток к пероксигеназ-ному стрессу можно считать также результаты, показанные при инкубации лейкозных клеток U-937 в присутствии хлорамфеникола и этидиумбромида. Последние повреждали дыхательные цепи митохондрий, но в этих же условиях наблюдалось повышение Se-зависимой и Se-независимой активности GPX, увеличение содержания мРНК GPX и гемоксигеназы (Bram-billa et al., 1997). Механизм индукции данного эффекта пока не установлен. Однако, как пред-ставляется нам, к его пониманию можно подойти с позиций того, что для рассматриваемых лейкозных клеток изначала характерны недостаточность митохондриального дыхания и соответственно определённая уже степень адап-тации их к состоянию гипероксии и пероксигенации. В этом смысле они имеют «опыт» и «подготовлены» к тому, чтобы при последующем ужесточении такого режима (в данном случае за счёт повреждения дыхательной цепи указанными веществами) усилить в пределах возможного антиоксидантную защиту и, в частности, активизировать экспрессию антиоксидантных ферментов.

Таким образом, гипероксическая среда культивирования, с одной стороны, ответственна за трансформацию адаптирующихся к ней нормальных клеток, но, с другой стороны, продолжает оказывать негативное, токсическое действие и на эти злокачественно трансформированные клетки, изменяя некоторые их свойства, причём не обязательно в сторону усиления злокачественности. Для полной окислительной деградации таких клеток необходим более высокий уровень в них дисбаланса ∆ (ПО – АО).

Наконец, для онкологии, теоретической прежде всего, принципиальными представляются данные о нормализации цитоскелетных структур и морфоло-гии трансформированных клеток in vitro. Как отмечают Бершадский и Ставров-ская (1988), «в ходе опухолевой прогрессии в результате тех или иных воздей-ствий в популяциях малигнизированных клеток могут появляться варианты с нормализованным фенотипом. Нормализация происходит по ряду параметров: прививаемости, росту в полужидкой среде, скорости размножения, морфоло-гии. Механизмы нормализации опухолевых клеток остаются неясными. Ряд наблюдений свидетельствует о том, что ревертанты, полученные в ходе раз-ных процедур отбора, нередко отличаются от исходных клеток увеличением размеров». С целью проверки подобных фактов эти авторы с помощью методов клеточной инженерии увеличили размеры исходных трансформированных кле-ток. При этом оказалось, что такие существенные качественные проявления, как распластывание клеток на субстрате и организация актинового скелета, неизменно возвращаются к близкому к норме состоянию. По итогам исследо-ваний они выдвинули гипотезу: одним из важных механизмов нормализации опухолевых клеток является восстановление их цитоскелета и контактов с субстратом в связи с увеличением размеров и изменением количественных соотношений между компонентами поверхности и цитоплазмы клеток.

Рассматриваемый феномен есть, очевидно, следствие увеличения не просто объёма малигнизированных клеток, но и содержания определённых внутрикле-точных соединений и образований, от функционирования которых прямо или косвенно зависит формирование цитоскелета, контактных и иных структур. Прежде всего, к числу возрастающих по количеству и размерам органелл отно-сятся, по-видимому, всё те же митохондрии. При нормализации цитоскелета (микротрубочек) как транспортной системы, участника организованных локали-зации и движения органелл, в том числе митохондрий (см. п. 2.3.5), и повыше-нии энергетической мощности интенсифицируются потребление О₂ и синтез ATP, снижаются внутриклеточное рО₂ и уровень ПОЛ. Эти изменения должны положительно отразиться на ATP-зависимом синтезе актиновых филаментов, а в условиях ослабления пероксидации должна возрасти активность адени-латциклазы, сопряжённой в норме с легкоокисляемыми фосфолипидами (см. п. 2.1.9). Вместе с достаточным количеством ATP это неминуемо приведёт к повышению концентрации cAMP и ко многим его эффектам, которые имеют антипролиферативную и противоопухолевую направленность. Среди них такие уже отмечавшиеся нами, как cAMP-стимулируемые фосфорилирование PKA тубулина, необходимое для полимеризации и функционирования микро-трубочек, синтез адгезивных молекул и образующих щелевые контакты белков (см. рис. 16, п. 2.3.4 и 2.4.2).

В обобщённом виде некоторые вышеизложенные положения представлены на рис. 22.

Культивирование нормальных клеток в условиях периодически создаваемого анаэробиоза

Деградация части дыхательных ферментов и митохондрий при кислородном голодании и дефиците АТP

Установление в клетках гипероксии и избыточной свободнорадикальной пероксидации после устранения кислородного ограничения (состояния аноксии)

Злокачественное перерождение части клеток по кислородно-перекисному механизму при устойчивом поддержании в них «канцерогенных» значений

к (ПО-АО) < ц (ПО-АО)

Нормализация некоторых трансформированных клеток в результате индуцированного тем или иным способом стойкого снижения к (ПО-АО) до п (ПО-АО) или н (ПО-АО)

Рис.22. Возможные результаты культивирования нормальных клеток в режиме периодической аноксии

Окислительная деструкция части гипероксических клеток в связи с повышением в них (ПО-АО) до «цитолизных» значений ц (ПО-АО)

* * *

Среди других видов канцерогенеза злокачественная трансформация нор-мальных клеток при длительном их культивировании занимает особое место: прооксидантные условия in vitro сами по себе, по-видимому, создают необходи-мую канцерогенную ситуацию. Без всяких дополнительных воздействий извне какими-либо канцерогенными агентами и факторами эти условия способны малигнизировать клетку. Именно поэтому феномен «спонтанной» малигниза-ции рассмотрен в данной монографии, как частный, но наиболее «подготов-ленный» для понимания вариант общей кислородно-перекисной модели кан-церогенеза. Прийти к такому выводу психологически было нелегко из-за всё ещё господствующего мнения о том, что канцерогенез и сопровождающие его процессы и продукты ПОЛ обусловлены гипоксическими условиями, а не гипероксическими. В доказательство этого положения в литературе приводи-лись результаты некоторых экспериментов с культурами нормальных клеток, которые, с нашей точки зрения, интерпретировались недостаточно корректно.

Спонтанной малигнизации должна содействовать способность культур эндотелиальных клеток, гранулоцитов, фибробластов и некоторых других ти-пов клеток продуцировать анион-радикалы О . Образование последних, прямо пропорциональное длительности инкубации и плотности клеточных культур, усиливается при периодическом перемешивании культуральной среды (Murrell et al., 1989). На примере культивируемых фибробластов человека показано, что они сами по себе продуцируют свободные радикалы О₂ в концентрации, стиму-лирующей их пролиферацию. «Тушители» свободных радикалов, как и экзоген-ные свободные радикалы, оказывают подавляющее действие на пролиферацию фибробластов (Murrell et al., 1990). Сходный эффект наблюдается в экспери-ментах, где свободные радикалы генерировали, добавляя в культуру фиброблас-тов кожи человека на 3-5-м пассажах гипоксантин и ксантиноксидазу. В малой концентрации (5·10^–7 – 10^–4 Е/мл) ксантиноксидаза повышала пролиферацию клеток на 20-70 %, а более высокие её концентрации (5 10^–3 – 10^–2 Е/мл), наоборот, снижали пролиферацию на 60-90 %. Как стимулирующий, так и ингибирующий эффекты ксантиноксидазы подавляются при её тепловой инак-тивации, добавлении в среду ингибитора этого фермента аллопуринола или скавенджеров кислородных радикалов – SOD, каталазы (Murrell et al., 1989).

С нашей точки зрения, приведённые факты чётко отражают проявление in vitro двух противоположных феноменов: в небольшой концентрации «туши-тели» свободных радикалов и другие антиоксидантные факторы могут несколь-ко снижать или, напротив, повышать пролиферацию клеток в зависимости от конкретных уровней образующихся в них органических пероксидов и дисба-ланса ∆ (ПО – АО); слишком же высокие концентрации АФК всегда усиливают пероксигенацию до уровня, вызывающего негативные последствия в клетках и тканях. Эти же мотивы, по существу, проявляются и при спонтанной малиг-низации клеток в условиях культуры, когда отсутствуют даже какие-либо специальные воздействия извне. В гипероксической среде культивирования гетерогенный состав клеток ведёт себя по-разному. Одни из них не выдержи-вают непривычного токсического состояния и подвергаются апоптозу или окис-лительному цитолизу. Другие же постепенно адаптируются к этой ситуации, восстанавливают и даже повышают свой вначале сниженный пролиферативный потенциал и, в конечном итоге, трансформируются в злокачественные клетки согласно кислородно-перекисному механизму. Другими словами, в гетероген-ных клетках культуры могут устанавливаться разные значения дисбаланса ∆ (ПО – АО) из ряда ∆_П < ∆_А1 < ∆_К < ∆_А2 < ∆_Ц (см. п. 7.1), от которых зависит конкретный индуцируемый из числа указанных кислородно-перекисный про-цесс, в том числе «спонтанная» малигнизация соответствующих клеток.

Отдельные факты нормализации опухолевых клеток в культуре отражают адаптивную их перестройку в ответ на различные процедуры отбора. Основным внутриклеточным фактором, способствующим возникновению ревертантов, постулируется нами нормализация в них энергетических процессов за счёт увеличения количества и размеров митохондрий, снижения «канцерогенезного» дисбаланса ∆_К (ПО – АО) до «нестимулированного» ∆_Н (ПО – АО) или «про-лиферативного» ∆_П (ПО – АО) уровней в норме.

Изложенные представления о спонтанной малигнизации клеток в условиях культуры не являются универсальными, а в отношении некоторых категорий клеток недостаточно реализуемыми. Это касается, прежде всего, эмбриональ-ных и стволовых клеток, в том числе полипотентных кроветворных и клеток-предшественников отдельных ростков кроветворения, ввиду присущих им осо-бенностей (см. п. 2.5). Речь идёт о том, что указанные клетки отличаются малым количеством митохондрий, слабой интенсивностью митохондриального дыхания и соответственно повышенными в них уровнями рО₂ и дисбаланса Δ (ПО – АО). В таких относительно оксистрессовых условиях активно проли-ферирующие и дифференцирующиеся эмбриональные и гемопоэтические кле-тки нормально функционируют в режиме чередования окислительного митоге-неза и окислительной дифференцировки. Эта особенность отчасти проявляется, по-видимому, и при культивировании их в гипероксических условиях in vitro. Возможным подтверждением тому служат следующие данные.

В длительных культурах костного мозга мышей, дефицитных по TNF, выявляются некоторые признаки неопластической трансформации: нестабиль-ность генома, гиперплоидия в клетках, увеличение суммарной клеточной попу-ляции, продолжительное поддержание кроветворения и др. Однако при в/б и в/в инъекциях клеток из суспензионной фракции у реципиентов с нормальным и ослабленным иммунитетом не образуются опухоли. С другой стороны, в тех же культурах не происходит блокирования клеточной дифференцировки, и в целом длительное самоподдержание кроветворных предшественников в культуре кос-тного мозга мышей, дефицитых по TNF, не является следствием опухолевой трансформации (Эршлер и др., 2002). Тем не менее, приведённые факты вовсе не означают, что указанные гемопоэтические клетки не трансформировались в лейкозные. Последние известны как просто остановленные в своей дифферен-цировке на стадии клетки-предшественницы (Абелев, 2001) и способны под действием многих агентов и факторов продолжить дифференцировку вплоть до терминальных форм.

В целом же изучение спонтанной малигнизации клеток в процессе их куль-тивирования важно не только с позиций установления единого механизма кан-церогенеза, существование которого не подлежит сомнению. С учётом того, что большинство агентов, индуцирующих опухоли в организме, оказываются спо-собными вызывать трансформации и в культурах, естественно использовать последние для апробирования профилактического и противоопухолевого дей-ствий различных агентов и факторов. В осмыслении получаемых эффектов может быть полезной и изложенная нами концепция «спонтанной» малигни-зации клеток в условиях культуры.

Г л а в а 5

КАНЦЕРОГЕНЕЗ, ИНДУЦИРУЕМЫЙ ИНОРОДНЫМИ ТЕЛАМИ

Инородные небиогенные тела могут попасть в организм человека и живот-ных как в силу каких-то случайных обстоятельств, так и при использовании различных внутритканевых и органных протезов из полимерных и иных материалов. Актуальность изучения возможных неблагоприятных последствий для организма такого протезирования очевидна. Основанием для беспокойства здесь служат факты индуцирования канцерогенеза инородными телами и изме-нения форменных элементов крови. Чаще всего встречаются ситуации, когда в производственных условиях (на предприятиях, добывающих или производящих асбест, цемент, керамику, стекло, фрикционные и изоляционные материалы) люди вдыхают природные или искусственные минеральные частицы. Установ-лено, что такие частицы, особенно волокнистые, причастны к возникновению со временем очагов новообразований в дыхательных органах.

Молекулярный механизм и биология опухолевого роста, индуцируемого синтетическими полимерными материалами, природными и искусственными минералами, остаются пока неясными. В данной главе на этот счёт развиваются некоторые новые представления. Наша задача – попытаться исходя из общей кислородно-перекисной концепции канцерогенеза (см. главу 2), фактов секре-ции макрофагами различных биоокислителей и некоторых иных данных, пред-ставить механизм полимерного, асбестового и других видов профессионального канцерогенеза. Это важно не только для широкого безопасного применения полимеров и других материалов в медицинской практике, но и при разработке единого механизма онкогенеза.