1.3. Митохондрии – наиболее уязвимое и основное «стартовое» звено в старении клетки

Анализ многочисленной литературы показывает, что наиболее изученными в возрастном аспекте внутриклеточными органеллами являются митохондрии. Внимание исследователей на них обращено в связи с явным при старении ослаблением процессов энергетического метаболизма (Lestienne, 1997; Ozawa, 1997a, 1999; Литошенко, Хартвиг, 1998), которое практически во всех работах объясняется дефектностью данных органелл. Вообще же, о дегенеративном изменении структуры и функций митохондрий при старении известно уже давно (Weiss, Lansing, 1953). В последующие годы и десятилетия эти факты многократно подтверждались исследователями разных стран (Нагорный и др., 1963; Tauchi, Sato, 1968; Озернюк, 1978 и др.). В обобщённом виде с учётом более поздних публикаций они приводятся ниже. При этом мы исходили из того, что все изменения митохондрий должны быть логически и функционально увязаны между собой на базе какой-нибудь заслуживающей внимания концепции. Такой системный подход может быть, в частности, реализован на основе представлений о кислородно-перекисном механизме старения клетки.

1.3.1. Внутренняя мембрана митохондрий, на которой локализована дыхательная цепь, отличается, как известно, высоким содержанием фосфолипидов с большой в норме степенью ненасыщенности. Это означает, что при наличии дисбаланса  (ПО – АО) митохондрии потенциально высокоуязвимы ввиду повышенной чувствительности их к ПОЛ, о чём свидетельствуют многие публикации о возрастном увеличении в митохондриях интенсивности образования различных АФК и перекисей липидов (Sawada, Karlson, 1987; Sohal, 1994; Tsay et al., 2000; Pfenty, Mignotte, 2001 и др.). К тому же свободнорадикальные продукты, возникающие уже в ходе нормального функционирования дыхательной цепи митохондрий (Скулачев, 1997; Turrens, 1997; Barja, 1999; Pedersen, 1999), в первую очередь опасны для молекулярных структур самих митохондрий. Прежде всего, инактивируются мембраносвязанные и липидозависимые ферменты дыхательной цепи.

Особенно значительна роль изменений в цитохромной системе – последнем звене, обусловливающем использование О₂ в терминальных стадиях биологического окисления. Падение активности цитохромоксидазы и содержания цитохромов а+а₃, с+с₁ приводит к снижению окислительной способности митохондрий (скорости потребления О₂), в результате работа дыхательной цепи не обеспечивает образование достаточного мембранного потенциала для синтеза АТР (Литошенко, 1986; Chen et al., 1998). С инактивацией цитохромоксидазы при избыточном ПОЛ и угасанием функций митохондрий старение клеток ускоряется (показано на гепатоцитах крыс Sprague-Dawley). А каталаза, SOD, GPX, GSH, NO, элиминируя пероксиды, могут защищать цитохромоксидазу и клетку от окислительного стресса, от старения и рака (Ota, 1998). От возраст-ного снижения активности цитохромоксидазы в митохондриях печени мыши защищает также тиоловый антиоксидант N-ацетилцистеин. Последний повышал активность фермента in vitro и в синаптических митохондриях, выделенных от молодых и старых мышей. При этом оптимальная концентрация антиоксиданта для максимального увеличения активности цитохромоксидазы состав-ляла 5 мМ для препаратов, полученных от молодых животных, и 10 мМ – от старых (Banaclocha, Martinez, 1999).

В связи с указанным понятно различие окислительного фосфорилирования в митохондриях печени мышей с ускоренным старением (SAMP8) и животных, устойчивых к старению (SAMR1). У 18-месячных мышей SAMP8 не обеспечивается синтез АТР, необходимый для нормального клеточного обмена, и отношение АТР/О₂ соответственно уменьшалось. Подавлялось также зависимое от динитрофенола разобщённое дыхание, что указывало на дисфункцию митохондрий. Влияние старения на эти функциональные параметры у мышей SAMR1 было смягчённым. Низкую продолжительность жизни мышей с ускоренным старением связали, естественно, с нарушением у них функции митохондрий (Nakahara et al., 1998). Сходные в принципе результаты получены при иссле-довании активности ферментативных систем генерации АФК у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS в следующих двух экспериментах.

В одном случае, повышенная чувствительность крыс линии OXYS к окислительному стрессу коррелировала со сниженной способностью выделенных из их печени митохондрий восстанавливать О₂ и нарабатывать О и Н₂О₂. Речь здесь идёт, очевидно, об АФК, образующихся в процессе работы дыхательной цепи. Оказалось, что падение продукции О митохондриями крыс связано с изменениями в комплексе III цепи переноса электронов (Меньшикова и др., 2000). В другом случае, с помощью электронной микроскопии показано, что уже с 12-месячного возраста регистрируются признаки дегенеративно-дистро-фических изменений гепатоцитов крыс линии OXYS. Это происходит на фоне функциональных нарушений митохондрий: снижения скорости поглощения О₂ во всех метаболических состояниях, величины дыхательного контроля, коэффициента ADP/O, трансмембранного потенциала и скорости фосфорилирования (Колосова и др., 2001). Авторы обеих этих работ полагают, что прогрессиру-ющая дисфункция митохондрий, является «ключевым фактором патогенеза преждевременного старения и болезней, связанных с окислительным стрессом у крыс OXYS».

Крайне интересен также факт обнаружения в мозге мышей линии с генетически ускоренным процессом старения повышенного уровня митохондриальной моноаминооксидазы Б. Как полагают (Юнева и др., 1998), по этой причине в тканях мозга животных с возрастом усиливается индуцибельность ПОЛ. Действительно, чтобы понять данный эффект, надо иметь в виду, что ами-нооксидазы катализируют реакцию окислительного дезаминирования многих низкомолекулярных азотистых соединений:

R-CH₂-NH₂ + О₂ + H₂О → R-CHО + NH₃ + H₂О₂,

где R – жирно-ароматические или алифатические радикалы, причём образующиеся в этой реакции АФК способны индуцировать ПОЛ мембран. В частности, моноаминооксидаза, локализованная во внешней мембране митохондрий, может нарушить, прежде всего, её (Каган и др., 1984а), а также способствовать повреждению, по-видимому, и внутренней мембраны. Таким образом, феномен ускоренного старения в указанном выше случае вполне согласуется с негативными «пероксидативными» сдвигами в митохондриях. Аминооксидазная тема затрагивается нами также в п.2.3.3 в связи с обсуждением и обоснованием кислородно-перекисной модели канцерогенеза.

Указанные эффекты возникают, несмотря на существование в нормальной аэробной клетке специальных механизмов защиты её от избыточного образования АФК (см. Скулачев, 1996). Одним из возможных способов такой защиты митохондрий и клетки в целом считают также утечку протонов через митохондриальные мембраны – процесс, сопровождающийся термогенезом и в норме требующий для своего возмещения затраты значительной части энергоресурсов (Rolfe, Brand, 1997). Протекторную функцию утечки протонов логично объяснить интенсификацией митохондриального дыхания и соответственно производства тепла, снижением уровней рО₂ в митохондриях и в клетке, а, сле-довательно, и концентрации в них АФК, скорость образования которых прямо зависит от рО₂ (Fridovich, 1975).

Не менее существенно, что снижение митохондриального дыхания, даже при уменьшенной подаче О₂ в клетки, является при старении организма преобладающим фактором, который неизбежно повышает уровень внутриклеточного рО₂ и содержание АФК, усиливая в качестве положительной обратной связи прооксидантную составляющую дисбаланса  (ПО – АО). Вообще же, феномен внутриклеточной гипероксии предопределяется тем фактом, что митохондрии являются основными потребителями О₂: в зависимости от типа клеток они утилизируют до 85-99 % всего О₂, поступающего в клетку (Кольтовер, 1996), и даже незначительное подавление дыхания должно почти автоматически повысить в ней уровень рО₂. Это положение, аргументированное нами ещё в 70-х годах (Лю, Ефимов, 1976), хорошо согласуется с известными данными о чрезвычайно высокой чувствительности внутриклеточного рО₂ к изменению интенсивности дыхания (см. Лю, Шайхутдинов, 1991 – п.1.1.4). Впоследствии наличие указанных принципиально важных эффектов, по существу, признано и некоторыми авторитетными учёными в области биоэнергетики и биохимии. В частности, Скулачев (Skulachev, 1996) отмечает, что авария митохондрий как атомных энергостанций клетки чревата обрушением на неё потока АФК (ОН^·˙ и др.), а механизм нормального функционирования митохондрий, предотвращает образование излишних АФК.

В условиях избыточного рО₂ естественны различные негативные процессы. Наглядный пример тому – достоверное увеличение с возрастом отношения окисленного глутатиона к восстановленному (GSSG/GSH) в митохондриях, выделенных из клеток печени, почек и головного мозга крыс и мышей. Ассоциированное с возрастом окисление глутатиона и образование пероксидов в митохондриях предотвращается при пероральном введении животным антиоксидантов (Garcia et al., 1996; Sastre et al., 1998). Изменённый фосфолипидный состав митохондрий гепатоцитов у 18- и 24- месячных крыс, тесно связанный с окислительным повреждением, играет важную роль в возрастном разрушении митохондрий в старости. У животных этих групп значительно увеличено содержание MDA и фосфолипазы А₂ по сравнению с получавшими предвари-тельно витамин Е или с более молодыми (Sun et al., 1997). Несколько раньше было показано, что митохондрии скелетной мышцы человека и мышей при старении подвергаются значительным деструктивным изменениям, причём мышечные клетки содержат среди миофибрилл липофусцин нередко в тесной связи с повреждёнными митохондриями. Изменения последних были сходны с обнаруженными ранее в лимфоцитах, но количественно аномалии в мышечных клетках были больше (Beregi et al., 1988). Образование липофусцина в них – очевидный показатель возрастной интенсификации ПОЛ.

В процессе старения наблюдается накопление и окисленных митохондриальных белков, содержащих реакционноспособные карбонильные группы. Наличие последних создает возможность образования внутри- и межмолекулярных сшивок, что приводит к потере функциональной активности белков (Ames et al., 1995). Любопытно, что оцениваемая по содержанию карбонилов окислительная модификация белков митохондриальных мембран при старении происходит уже на уровне насекомых. Так, на примере старения летательной мышцы домашней мухи показана значительная окислительная модификация адениннуклеотидтранслоказы митохондрий, сопровождавшаяся потерей её активности. Содержание мух в атмосфере 100 % О₂ и в среде, генерирующей ОН˙, также приводит к повышению содержания карбонильных групп и инактивации указанного соединения (Yan, Sohal, 1998).

При старении в митохондриях миокарда и печени крыс вследствие воздействия высокореактивных АФК повреждается ключевой энзим окислительного фосфорилирования F₀F₁-АТР-синтетаза. Возрастные нарушения структуры и функции этого фермента воспроизводятся in vitro при воздействии свободных радикалов на субмитохондриальные частицы (Guerrieri et al., 1995). А недавно было показано, что 4-гидрокси-2-ноненаль может понижать митохондриальное дыхание путём ингибирования -кетоглутаратдегидрогеназы – ключевого фермента образования NADH, и с этим фактом связываются потенциальный механизм влияния ПОЛ на дисфункцию митохондрий и роль последней в некоторых дегенеративных процессах (Humphries et al., 1998).

Снижение дыхательной активности митохондрий, их количества и качества в целом объясняется и более серьёзными нарушениями их структуры и свойств при старении. Объектом постоянной атаки АФК и продуктов липопероксидации, генерируемых на внутренней мембране митохондрий, оказывается локализованная рядом с ней, в матриксе, митохондриальная ДНК (мтДНК). Последняя не защищена белками и механизмы её репарации менее эффективны, чем яДНК. Авторы обзора «Распад митохондрий при старении» (Ames et al., 1995) приводят конкретные данные о повышении уровня окислительного повреждения мтДНК в процессе старения и, в частности, указывают, что скорость эволюционной мутации мтДНК в 17 раз превышает таковую яДНК. При окислительной модификации мтДНК частично фрагментируется, некоторые из фрагментов могут выйти из митохондрий. Накопление в геноме митохондрий заметного числа повреждений приводит к нарушению механизмов репликации и транскрипции, замедлению биогенеза митохондрий, к уменьшению в клетке фонда этих органелл, нормально выполняющих функцию генерации энергии. Такие факты были установлены ещё в прошлые десятилетия (Озернюк, 1978; Eleming et al., 1982; Miquel et al., 1984; Литошенко, 1986; Richter, 1988).

В последующие годы данные об окислительном повреждении мтДНК, выделенной из тканей старых людей и животных, подтверждались и приводились в литературе неоднократно. Большинство исследователей связывает эту составляющую процесса старения митохондрий и клетки в целом с пониженной надёжностью электронотранспортных мембран и образованием токсичных радикалов О₂ (Кольтовер, 1987; Литошенко, 1992; Beckman et al., 1992; Mecocci et al., 1994; Sohal, 1994). Об этом свидетельствует и более поздняя сводка материалов о способности кислородных радикалов инициировать реакции окисления нуклеотидов мтДНК (Кольтовер, 1996; Garcia et al., 1996; Литошенко, Хартвиг, 1998). Такие повреждения не могут не отразиться на количественном и качественном составе мтДНК, на синтезе ферментов окислительного фосфорилирования, контролируемом митохондриальным геномом.

Отметим, например, работу, в которой для исследования роли мтДНК в процессе старения использовали лиц в возрасте от 20 недель до 103 лет. Оказалось, что имеет место существенное возрастзависимое снижение содержания мтДНК в клетках при отсутствии, правда, какой-либо корреляции со снижением скорости потребления О₂ (Landerman et al., 1995). Кстати, измерение числа копий мтДНК, количества субъединицы I цитохромоксидазы, уровня её транскрипции и ферментативной активности в различных мышцах, печени и сердце у 6- и 27-месячных крыс показало следующее. Значительное уменьшение с возрастом числа копий мтДНК имело место в скелетных мышцах и печени, но не в сердце. Экспрессия же гена цитохромоксидазы носила тканеспецифический характер (Barazzani et al., 2000).

Все сдвиги, подобные указанным выше, и митохондриальную теорию ста-рения в целом Зотин и Зотина (1993) обосновывают с позиций термодинамически неравновесных процессов. Лемешко же (1992), рассматривая биоэнергетические аспекты механизма старения, наиболее важным считает модификацию ядерного генома фрагментами мтДНК, образование и выход которых из матрикса зависят от кальция и свободных радикалов. Такая модификация должна обнаруживаться не только при старении, но и, очевидно, при обусловленных им возрастных болезнях (см. п.1.7), к числу которых относится и рак. Как на факт присутствия в яДНК опухолевых тканей вставок, подобных мтДНК, можно сослаться, например, на данные Хадлера и соавт. (Hadler et al., 1998). Содержание этих вставок в опухолях мыши и крысы было существенно выше, чем в гомологичных нормальных тканях. Кроме того, мтДНК-содержащие последовательности в ядерном геноме обладали повышенной мобильностью.

1.3.2. Особого внимания заслуживает взаимосвязь процесса старения чело-века и разных видов животных с разнообразными делециями мтДНК. По этой тематике опубликовано немало работ (Yen et al., 1992; Gadaleta et al., 1994; Katsumata et al., 1994; Lee et al., 1994; Miyabayashi et al., 1994; Орличенко, Литошенко, 1995 и др.). Целая серия их была представлена, например, в журнале «Age» за 1995 год (№ 3-4), и некоторые из них ниже кратко комментируются нами. Существенными, в частности, представляются следующие факты. Делеции мтДНК в различных тканях человека возникают в процессе его старения вследствие внутримолекулярной «незаконной» рекомбинации либо при репликации и приводят к образованию субгеномных молекул ДНК. Идентифицированы 2 класса делеций: гомологичные по точкам разрывов с субгеномными молекулами, идентичными по размерам; гетерогенные по точкам разрывов с образованием субгеномных молекул, различающихся по размерам (Baumer et al., 1994). Изучение с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) делеций мтДНК в процессе старения мышей и крыс показало, что с возрастом скорость возникновения таких повреждений постоянно повышается (Kang et al., 1995).

У млекопитающих появление возрастных делеций мтДНК наиболее харак-терно для нервной и мышечной тканей (Aiken, 1995). У старых 25-месячных мышей методом ПЦР в мтДНК мозга выявлены 3 перекрывающихся делетированных фрагмента, которые затрагивали часть генов цитохромоксидазы, некоторых дегидрогеназ и тРНК (Brossas et al., 1994). Активность ферментов дыхательного комплекса 4 митохондрий из четырёхглавой мышцы бедра обезьян падала с возрастом. В частности, увеличивалось количество мышечных волокон, не дающих реакции на цитохром-с-оксидазу, причём в 89 % таких волокон имелись делеции мтДНК (Lee C. M. et al., 1998). Мелов же с соавт. (Melov et al., 1995), подтвердив увеличение в процессе старения числа делеций в мтДНК из скелетных мышц человека, отметили также, что эти перестройки гетерогенны, различаются у отдельных индивидуумов и являются общими для всех многоклеточных животных. В ряде работ (Aspnes et al., 1997 и др.) выяв-лен и другой факт: ограничение питания препятствовало накоплению делеций мтДНК, т.е. показаны потенциальные возможности данного «терапевтичес-кого» подхода для поддержания интегративных функций митохондрий при старении.

Наиболее частой мутацией в мтДНК из накапливающихся в течение нормального старения считается делеция 4977 п. н., которую называют «обычной делецией». Последняя происходит, кстати, и при повторяющейся обработке фибробластов человека сублетальной дозой УФ-облучения, причём данный эффект связан с образованием синглетного О₂ (¹О₂). Обработка необлучённых клеток таким ¹О₂, полученным в процессе терморазложения эндопероксида, приводила к той же «обычной делеции» мтДНК (Berneburg et al., 1999).

Пробы мтДНК из скелетных мышц пациентов со старческой миопатией и здоровых доноров пожилого возраста, проанализированные методом ПЦР, под-вердили высокую частоту «обычных делеций», но в ряде случаев высокой была и частота делеций, точки разрыва которых были за пределами типичных «горячих точек» мутирования мтДНК (Shoubridge, 1995). Из этой же работы следовало, что старческая дистрофия мышц связана с интенсивным накоплением транс-криптов делетированных молекул мтДНК. В качестве примера приводятся тран-скрипты мутантного гена цитохрома в, которые уже не способны транслироваться в активный фермент. В опытах на биопсийных образцах скелетных мышц людей разного возраста выявлена прямая корреляция между структур-ной аномалией мтДНК и снижением активности комплексов дыхательной цепи митохондрий. При этом максимальное относительное содержание делетированных молекул мтДНК наблюдалось в возрасте 80 лет, что совпадало с периодом выраженного снижения активности дыхательной цепи (Lezza et al., 1994). Особенно примечательны данные сравительного анализа делеционных мутаций в митохондриях нормальных и повреждённых мышечных волокон у пожилых людей: протяжённые делеции в мтДНК обнаружены во всех 29 исследованных образцах на участках с нарушениями в системе электронного транспорта и отсутствуют на соседних нормальных участках (Cao Z. et al., 2001).

Весьма убедительны и данные Мюллера-Хокера (Müller-Hocker, 1994) о возрастном нарушении дыхательной цепи митохондрий, связанном с уменьшением активности цитохромоксидазы в диафрагме, сердечной и глазной мышцах, в отдельных сегментах скелетных мышц и др. Показаны снижение активности субъединиц этого фермента, кодируемых в ядерном и митохондриальном геномах, накопление делеций в определённых позициях и уменьшение количества мтДНК. Исследованием мтДНК в биоптатах мышц людей в возрасте 17-89 лет с помощью той же ПЦР установлен многократный рост числа делеций с увеличением возраста, что обусловлено «накоплением оксидативных повреждений мтДНК» (Gadaleta et al., 1994). Частота делеций мтДНК у больных с предсердной фибрилляцией ассоциирована не только с этой патологией, но и с увеличением их возраста, что приводит к биоэнергетической недостаточности в миоцитах предсердий. Правда, авторы данного исследования (Tsuboi et al., 2001) считают пока неясным, являются ли делеции мтДНК причиной или следствием дефектов в систезе ATP, старения, гемодинамических нарушений и предсердной фибрилляции. Возрастную митохондриальную миопатию могут ускорять инфекционное заболевание, стресс и физическое перенапряжение (Miyabayashi et al., 1994). Интересно, что в отличие от делеций точковые мутации в мтДНК из скелетных мышц человека не накапливаются по мере старения (Palloti et al., 1996).

Делеции мтДНК имеют место и в других тканях стареющих людей. Примечательны, например, данные о возрастном снижении активности цитохромоксидазы в фибробластах. У здоровых лиц это снижение происходило быстро после 40 лет, а у 96-летнего индивида активность указанного фермента составляла всего 10 % от активности у плода. Фенотип мутантной мтДНК проявлялся лишь при преобладании его над диким типом в 3 раза (Miyabayashi et al., 1994). Число митохондриальных дефектов увеличивается с возрастом экспоненциально, причём в процессе старения они накапливаются только в постмитотических клетках. В тканях же здоровых людей в возрасте до 25 лет делеции не выявляются. Как полагают авторы данного исследования (Wei J.-H. et al., 1995), зависимое от возраста накопление делеций и тандемных дупликаций мтДНК может значительно ухудшить экспрессию генов и дыхательные функции митохондрий в стареющих клетках. Более того, повреждение мтДНК они склонны считать «начальным молекулярным событием процесса старения человека». Сходные результаты получены в работе (Kadenbach et al., 1995), где накопление делеционных и точковых соматических мутаций в мтДНК по мере старения различных тканей человека признаётся стохастическим процессом, но в целом такое накопление приводит к нарушению в клетке энергетического обмена, если количество нормального, неповреждённого мтДНК составляет менее 90 %.

Более детальная и впечатляющая информация по данному вопросу представлена в работе Озавы (Ozawa, 1995). Подтвердив, что следствием возрастной аккумуляции мутаций мтДНК являются дефицит энергии, смерть клетки и старение организма, он, кроме того, по результатам полного секвенирования мтДНК от 48 субъектов показал: наследуемые точковые мутации мтДНК ускоряют свободнорадикальное повреждение и делеции мтДНК, приводя к образованию более 100 типов повреждённых минициркулярных молекул мтДНК, с которыми ассоциированы преждевременное старение и дегенеративные заболевания. Решающим же итогом исследования Озавы представляется выявление корреляции содержания делеционных форм мтДНК с клинической выраженностью фенотипов этих болезней и сроками жизни больных. В последующем он же (Ozawa, 1997a, 1999) детально обобщил материалы по генетическим и функ-циональным изменениям митохондрий, связанные со старением, особо обратив внимание на: действие АФК на мтДНК, её фрагментацию и точковые мутации; возникновение биоэнергетического кризиса; высвобождение апоптогенных факторов в цитоплазму; дегенерацию тканей, атрофию и старение.

Здесь к месту будет сказано, что в зависимости от значений постулируемых нами «специализированных» диапазонов дисбалансов Δ (ПО –АО) в клетках в результате дисфункции митохондрий могут устанавливаться (после «старительного» дисбаланса Δ_С, с которым связано и возникновение возрастных патологий) «апоптозный» Δ_А1, «канцерогенезный» Δ_К, «апоптозный» Δ_А2 и «цитолизный» Δ_Ц дисбалансы (см. п. 1.1.2 и 7.1). Одним из примеров индукции апоптоза А1 при старении в связи с недостаточностью митохондриального дыхания является, по-видимому, апоптоз нервных и мышечных клеток, а также лимфоцитов мышей (Rottenberg, Wu, 1997); причастность дисфункции митохондрий и Δ_К к канцерогенезу подробно обоснована в главе 2, а рассмотренитю апоптозов А1, А2 и окислительного цитолиза при дисбалансах в клетках соответственно Δ_А1, Δ_А2 и Δ_Ц посвящена глава 7.

Аналогичные материалы по делеции мтДНК представлены и рядом других исследователей (Gadaleta, 1996; Kagawa et al., 1997; Kovalenko et al., 1997; Lestienne, 1997; Melov et al., 1997; Gadaleta et al., 1998), а подробная сводка данных литературы по обсуждаемой проблеме приведена в обзоре «Возрастные изменения генома митохондрий» (Lee et al., 1997). Существенно, что такие изме-нения, будучи общими для всех живых организмов, по интенсивности их накопления отличаются в различных тканях как конкретного вида животного, так и у разных их видов. Например, количественное определение делеций мтДНК в 10 органах старых крыс показало: максимальное содержание делетированных молекул мтДНК было в печени, а наименьшее – в тонком кишечнике. В этих же органах активность SOD и GPX были соответственно самыми высокими и самыми низкими. Данный факт к тому же указывает на то, что возрастное накопление делеций мтДНК органов крысы коррелирует с оксидативным стрессом (Filser et al., 1997). По мере старения человека и крыс уровень мтДНК с делециями в мозге, печени, почках и скелетных мышцах возрастал, причём тканевое распределение делеций у обоих видов отличалось: у человека более высокой была частота делеций в мозге, печени и мышцах, а у крыс – в почках. Это означает, что старение на тканевом уровне у разных видов животных протекает по-разному (Zhang et al., 1997).

Устойчивое повышение числа делеций мтДНК наблюдалось и в процессе развития дрозофил от эмбриональной стадии до имаго, т.е. в период активного роста и метаболизма. На этом основании предложено использовать процесс развития дрозофил в качестве экспериментальной биологической модели для исследования делеций мтДНК (Schwarze et al., 1995). В целом факты выпадения определённых участков генетического материала митохондрий согласуются с данными цитированных выше работ о частичной фрагментации мтДНК при окислительной её модификации.

Обратим теперь внимание на следующий принципиальный момент. Интенсивность повреждения мтДНК различными АФК, как известно (Shigenaga et al., 1994; Пескин, 1997; Yakes, Van Houten, 1997 и др.), значительно выше, чем яДНК. Этот факт позже подтверждён ещё раз в экспериментах на клетках мыши с помощью модифицированного метода ПЦР. Более того, показана способность повреждений в мтДНК персистировать, т.е. сохраняться в ряду клеточных поколений, в то время как повреждения ядерного генома эффективно репарируются. По этим результатам авторами (Van Houten et al., 1998) сделан суще-ственный вывод: «механизм мутирования мтДНК под действием свободных кислородных радикалов с последующей персистенцией мутаций играет важную роль в накоплении аномалий мтДНК как факторе старения». Сходные в какой-то мере идеи заложены в математическую модель функционирования дефект-ных митохондрий, накопление которых признаётся главной причиной повреж-дения клеток при старении (Kowald, Kirkwood, 2000). Эта модель, учитывающая сокращение продукции ATP и уменьшение протонного градиента в повреждённых митохондриях, допускает более медленные их репликацию и деградацию, что даёт им селективное преимущество, приводя к их клональной экспансии. С нашей же точки зрения, основное «преимущество» дефектных митохондрий, по отношению к полноценным, состоит в сниженном потреблении О₂, которое постоянно поддерживает в содержащих их клетках повышенные кислородно-перекисные условия, ответственные за повреждение и старение клеток.

Из сказанного выше со всей очевидностью следует, что мутации в мтДНК являются одним из главных факторов создания в клетке условий для окислительного стресса, лежащего в основе кислородно-перекисной концепции ста-рения. В этой связи представляется полезным обсудить и, по возможности, объяснить некоторые экспериментальные факты по снижению в такой ситуации чувствительности клеток к указанному стрессу. Рассмотрим, например, данные о зависимости окислительного стресса от Са²⁺ и действия циклоспорина А – ингибитора проницаемости пор во внутренней мембране митохон-дрий. Как оказалось, удаление Са²⁺ из культуральной среды полностью блокирует цитотоксическое действие окислительного стресса. Таким же эффектом обладает циклоспорин А (Wong, Cortopassi, 1997). С другой стороны, на примере тимоцитов показано, что разобщители окислительного фосфорилирования индуцируют открывание пор, через которые Са²⁺ быстро освобождается из митохондрий в цитозоль, а циклоспорин А чётко ингибирует этот процесс (Chernyak, 1997). Существенна также способность самого окислительного стресса стимулировать открывание пор (Halestrap et al., 1997).

Механизм реализации указанных взаимосвязанных эффектов в митохондриях пока не совсем «прозрачен». С учётом других известных фактов, наиболее привлекательной представляется следующая логика происходящих событий: 1) мутации в мтДНК, ответственные за дефектность окислительного фосфорилирования; 2) повышение уровней рО₂ и ПОЛ внутренней мембраны, падение на ней мембранного потенциала; 3) образование пор на внутренней мембране; 4) выход Са²⁺ из матрикса через эти поры; 5) активация им фосфолипазы А₂ на внешней поверхности внутренней мембраны; 6) переход митохондрий и клетки в целом в состояние умеренной окислительной цитотоксичности; 7) старение клетки по кислородно-перекисному механизму. Приведённые функционально связанные процессы позволяют понять, почему окислительный стресс, вызванный мутациями в мтДНК, зависит как от Са²⁺, так и действия циклоспорина А.

В норме репликация мтДНК происходит в условиях прикрепления её к внутренней мембране митохондрий (Литошенко, 1992); бόльшая часть мито-хондриальных рибосом также ассоциирована с этой мембраной (Минченко, Дударева, 1990). При избыточном ПОЛ связи мтДНК и рибосом с мембраной могут нарушаться, что должно отразиться на возможности нормальных упоря-доченных процессов репликации мтДНК и синтеза митохондриальных белков. Как известно, белки, кодируемые генами митохондрий и синтезируемые на их рибосомах, входят в состав мембран митохондрий и, следовательно, необхо-димы для образования упорядоченных мембранных ансамблей, для сборки этих функционально полноценных органелл. Между тем, при старении интенсив-ность синтеза белков митохондрий, особенно цитохромоксидазы, снижается (Eleming et al., 1985; Литошенко, 1986). Как выяснилось, возрастное падение эффективности митохондриальной трансляции может происходить и по другой причине. В оригинальных экспериментах с переносом ядер фибробластов кожи лиц разного возраста в клетки HeLa и обратного переноса ядер клеток HeLa в безъядерные фибробласты кожи людей разного возраста установлено, что снижение эффективности трансляции в митохондриях при старении обусловлено, в частности, накоплением рецессивных мутаций в ядерных генах, кодирующих факторы трансляции в митохондриях (Isobe et al., 1998).

Таким образом, сдвиги на этапе трансляции также ответственны за формирование дефектных митохондрий, снижение количественных и качественных их характеристик. С точки же зрения наследования простаренческого состояния в ряду клеточных поколений, более важным всё-таки представляется прогрессивное накопление в соматических клетках дефектов на уровне мтДНК (Hayakawa et al., 1996) и, прежде всего, тех нерепарированных мтДНК, из-за которых митохондриальное дыхание становится недостаточным, а внутриклеточный дисбаланс ∆ (ПО - АО) – повышенным. При накоплении мутаций в мтДНК нарушается скоординированная экспрессия генов, локализованных в мтДНК и ядерном геноме и кодирующих, в частности, субъединицы АТР-синтетазы, с чем должно быть связано возрастное снижение синтеза АТР (Kagawa et al., 1997). Изложенные выше соображения схематически представлены на рис. 2.

Примечательно, что важная роль повреждений мтДНК в старении и связанных с ним болезней привлекает внимание и специалистов не медико-биологического профиля, о чём свидетельствует разработка математической модели, описывающей некоторые последствия указанных повреждений (Beregovskaya, Maiboroda, 1995). Адекватно построенные модели могут быть эффективным средством углубления познаний и прогнозирования новых эффектов и закономерностей, заложенных природой в триаде «дефекты биоэнергетики – старение – возрастные патологии». Справедливости ради следует отметить, что в единичных работах взаимосвязь между возрастом и активностью дыхательной цепи митохондрий не обнаруживается (Chretien et al., 1998).

1.3.3. Возрастное изменение морфоцитометрических показателей митохондрий из клеток различных животных и человека изучено наиболее подробно и хорошо отражает указанные выше структурные и функциональные их нарушения, причём некоторые исследователи описывают, по существу, одни и те же деструктивные изменения, пользуясь различными критериями их оценки. Например, зафиксированы такие данные: снижение отношения длины внутренних мембран к объёму клетки, укорочение крист и уменьшение количества митохондрий (Tate, Herbener, 1976); снижение отношения длины внутренних мембран к площади и объёму митохондрий, уменьшение в них крист и числа самих митохондрий при увеличении среднего их размера (Eleming et al., 1985); часть митохондрий имеет просветлённый матрикс, расширенные межкристные промежутки, дискомплексированные кристы; в определённом проценте митохон-дрий кристы и внутренние мембраны разрушены, а форма и размеры самих органелл изменены – наряду с обычными присутствуют крупные, а иногда гигантские (Фролькис, Ступина, 1982); уменьшение контурной длины крист митохондрий в расчёте на площадь этих органелл или на площадь клетки, снижение их количества при увеличении размеров оставшихся митохондрий (Литошенко, 1986).

Появление митохондрий больших размеров обычно рассматривают как реакцию компенсации на уменьшение фонда нормально функционирующих органелл, но действительной компенсации, по-видимому, не происходит ввиду дефектности и этих больших митохондрий в условиях избыточной пероксидации. Возрастное увеличение среднего размера митохондрий и изменение других морфоцитометрических параметров их Литошенко (1985) объясняет снижением при старении скорости синтеза белков, кодируемых митохондриями, при сохранении этой скорости для белков митохондрий ядерного кодирования. Такой дисбаланс в синтезе митохондриальных белков разного кодирования объясняется, возможно, тем, что при старении организма в яДНК возрастает представленность мтДНК-подобных последовательностей вследствие интеграции фрагментов или целых молекул мтДНК в ядерный геном (Мозжухина и др., 1994). Своё представление эти авторы подтвердили в экспериментах на крысах. В яДНК печени старых животных содержание мтДНК-подобных последовательностей возрастало до 240% по отношению к таковому у молодых крыс, причём

Повреждение дыхательных ферментов митохондрий

Снижение интенсивно-сти дыхания

Повышение внутрикле­точного уровня рО₂

ПОЛ

внутренней мембраны митохондрий

Снижения уровней АТР и сАМР

Активация гликолиза

Повреждение мтДНК, снижение ее содержания и синтеза белков митохондрий

Уменьшение общего количества митохондрий и увеличение дефектных

Снижение

общей «мощности» митохондрий

и потреб-

ления О₂

Воздействия на другие структуры клетки

(плазматическую мембрану, микросомы,

лизосомы, ядро и т.д.)

Рис.2. Схема развития пероксигеназного стресса в клетке

в процессе ее «митохондриального» старения

 (ПО-АО)

у последних эти последовательности локализованы преимущественно в репрессированной фракции хроматина, а у взрослых и старых животных – в транскрипционно-активной фракции. Однако, судя по отдельным сообщениям, эти структурно-функциональные перестроения могут и не быть закономерностью. Например, в репликативно стареющих фибробластах WI-38 и IMR-90 человека показано заметное снижение активности факторов транскрипции OXBOX-REBOX по связыванию с промоторами некоторых ядерных генов, кодирующих белки дыхательной цепи митохондрий (Lehtinen et al., 1996).

Показательно обобщение структурных проявлений старения клеток, осуще-ствлённое Ступиной с соавт. (1993). Используя морфо-функциональный анализ выявленных возрастных изменений в клетках различных органов, они разгра-ничили наиболее характерные для процесса старения сдвиги на деструктивные и адаптивные. Результаты такого качественного анализа, касающиеся, в частно-сти, деструктивных изменений митохондрий, практически полностью совпада-ют с рассмотренными выше. Двойственность же проявления перестроек мито-хондрий и других внутриклеточных структур при старении было бы логично увязать с уровнем дисбаланса ∆ (ПО-АО) в клетках, который различен на разных этапах процесса старения и индивидуален для каждой клетки (в связи с гетерохронностью этого процесса – см. п. 1.1.2). Таким образом, с возрастом тканевое дыхание и скорость потребления О₂ при любом субстрате снижаются не только из-за нарушения работы дыхательной цепи, но и вследствие умень-шения количества и, следовательно, общей «мощности» самих митохондрий. В итоге ещё более возрастают необходимые для старения внутриклеточные гипероксия и пероксидативный стресс.

Митохондрии могут деградировать как при гипероксии, так и при дефи-ците О₂ внутри них. В этой связи важно также разобраться с изменениями в процессах транспорта О₂ к самим клеткам. Как известно (Нагорный и др., 1963), возрастные изменения происходят и в сосудистой системе организма. Особенно значительны они в артериях и артериолах: стенки их в онтогенезе постепенно теряют эластичность, способность сосудов изменять свой просвет уменьшается, в их тканях наступают склеротические изменения, общее русло капилляров и аретриол сужается, а кровяное давление в системе увеличивается. Эти изме-нения вместе со старением эритроцитов и ухудшением функции внешнего дыхания, естественно, способствует затухающему в онтогенезе потреблению О₂ тканями организма. В описываемой ситуации доставка О₂ в клетки некоторых тканей в единицу времени может оказаться меньше физиологически необхо-димого его количества. Реакция таких клеток на дефицит О₂, скорее всего, будет однозначной: уменьшение количества дыхательных ферментов в соот-ветствии с О₂-зависимым механизмом регуляции их содержания (Murphy et al., 1984) и общей «мощности» митохондрий, т.е. адаптация к условиям кисло-родного голодания. Деструкция «лишних» митохондрий в условиях гипоксии и падение окислительного фосфорилирования могут, в частности, проходить по схеме (Сороковой, Владимиров, 1975): выход Са²⁺ из матрикса → активация фосфолипазы А₂ ионами кальция → дезынтеграция мембран митохондрий → нарушение их структуры и функций.

Тонкости О₂-зависмого механизма регуляции количества дыхательных ферментов пока ещё не установлены. Поэтому интересна работа, где путём создания ингибитором дыхания митохондриального стресса изучали связь между митохондриями и ядром в клетках человека. Оказалось, что при сни-жении дыхания митохондрий до 50-70 % от нормы в клетках наблюдается активация экспрессии цитохромов b₁ и c, которая опосредована повышением уровня Н₂О₂ в клетках и способствует процессу их выживания. При более выраженном ингибировании дыхания (до 40% от нормы) и соответственно более интенсивном возрастании содержания Н₂О₂ ядерные гены указанных цитохромов не активируются (Suzuki H. et al., 1998). Данные факты демонстрируют существование, по крайней мере, трёх взаимосвязанных принципиальных эффектов: ингибирование митохондриального дыхания ведёт к внутриклеточной гипероксии и соответственно к избыточности уровня АФК; последние и, в частности, Н₂О₂ привлечены к экспрессии различных ядерных генов, в том числе кодирующих дыхательные ферменты b₁ и c для митохондрий; эти проявления частично компенсируют нарушения (недостаточность) митохондриального дыхания, если они не глубокие.

Кстати, важно отметить здесь, что механизм регуляции экспрессии генов дыхательных ферментов концентрацией О₂ «внедрён» уже на уровне дрожжей. Показана, например, зависимость экспрессии нескольких ядерных генов Saccharomyces cerevisiae, кодирующих белки терминальной части дыхательной цепи (цитохром с, цитохром-с-оксидазу), именно от концентрации О₂, а не просто присутствия или отсутствия О₂ (Burke et al., 1997). Оказалось, что экспрессия некоторых генов (СОХ4, СОХ – СОХ9) постепенно снижается при изменении концентрации О₂ от 200 мкМ (воздух) до пороговой, которая для этих генов очень низка (0.5 – 1.0 мкМ). Ниже кислородного порога экспрессия резко падает. Правда, в этой же работе показано существование и «гипоксических» генов (СОХ5в, CYC7), экспрессирующихся только при падении концентрации О₂ ниже 0.5 мкМ, а также феномена коэкспрессии в определённом интервале концентрации О₂ «аэробных» и «гипоксических» генов, кодирующих соответствующие им изоформы цитохрома с и цитохром-с-оксидазы.

Примечательным также представляется другой факт: обнаружение уже на уровне простейших одноклеточных организмов, в частности у Dictyostelium, кислородного переключателя транскрипции. Речь идёт о том, что малая субъединица цитохром-с-оксидазы имеет две взаимообмениваемые изоформы, появление которых регулируется О₂ в зависимости от условий роста (в томчисле, по-видимому, и от концентрации О₂). Эти субъединицы кодируются соседними генами, связанными тандемно «голова – хвост» и разделёнными коротким межгенным сенментом, который и выполняет роль кислородного переключателя транскрипции. Такая структурная организация и различная стабильность изоформ субъединицы фермента объясняют необычную чувствительность к О₂ переключающего механизма (Bisson et al., 1997). Последний представляет, по существу, редкий в живой природе пример системы управления с переменной структурой.

Возвращаясь к вопросу о старении клетки, отметим, что ограничение по указанным выше причинам поступления О₂ к клеткам и соответственно снижение его потребления ими может вновь повысить внутриклеточное рО₂, т.е. соз-дать условия для поддержания достаточного по величине дисбаланса ∆ (ПО – АО) и продолжения процесса старения клеток. Такое состояние должно быть характерным в основном для позднего онтогенеза. При этом на некотором этапе старения может образоваться ситуация, когда вновь возросшие значения дисбаланса ∆ (ПО – АО) окажутся соответствующими диапазону изменения ∆_П (ПО – АО). Тогда в принципе может возникнуть состояние обновления тканей в старом организме (см. п.1.6.1) – феномен, кажущийся парадоксальным и в то же время весьма привлекательным для понимания механизма омоложения ряда систем организма в позднем онтогенезе.

Как косвенное свидетельство недостаточности митохондриального дыхания обращают на себя внимание и факты массивной продукции свободных радикалов О₂ стареющими клетками (гепатоцитами) при реоксигенации после пребывания их в состоянии аноксии (De Notaris et al., 1995). Для объяснения данного эффекта представляется аргументированным следующее наше суждение. При реперфузии гепатоциты молодых крыс с меньшими потерями переносят резкое возрастание дисбаланса ∆ (ПО – АО), поскольку их неповреждённые ещё старением митохондрии, являясь главным антикислородным фактором в клетке, более или менее эффективно потребляют О₂ и отчасти нейтрализуют скачкообразное повышение рО₂. В более же старых клетках уже частично дефектные митохондрии лишены возможности ощутимо влиять на снижение уровней рО₂ и ПОЛ. Такие гипероксические изнутри клетки интенсивнее продуцируют АФК, так как давно известно: скорость образования АФК в ходе многих ферментативных и не ферментативных реакций и самоокисления различных соединений прямо зависит от рО₂ (Fridovich, 1975). И ещё. По нашему представлению, чем дольше клетки молодых животных будут находиться в условиях аноксии, тем полнее и надёжнее они адаптируются к ней, сокращая, прежде всего, число своих митохондрий (см. выше), но при последующей реоксигенации ответная АФК-генерирующая реакция их будет приближаться к таковой стареющих клеток. Подробнее механизм реперфузионного (реоксигенационного) поражения клеток вообще обсуждается нами в главе 4 (п. 4.2.3).

Совершенно новый и, по-видимому, дополнительный канал для усиления окислительного стресса в стареющих клетках в принципе возможен, если принять во внимание данные следующего наблюдения. На второй год жизни у крыс происходит снижение активности переносчика пирувата и соответственно скорости поддерживаемого пируватом дыхания в митохондриях сердца. В этих органеллах выявлено также уменьшение ~40 % содержания кардиолипина. Введение таким крысам ацетил-L-карнитина почти полностью восстанавливало как транспорт пирувата и скорость дыхания до уровня молодых контрольных крыс, так и коррелировавшее с этими изменениями содержание кардиолипина (Paragies et al., 1999). Логика связи между этими эффектами, на первый взгляд, кажется не совсем понятной. Опираясь, однако, на «кислородно-перекисные» представления о механизме старения можно допустить реализацию некоторых процессов, обусловленных недостаточностью пирувата в матриксе митохондрий и реакций цикла трикарбоновых кислот. Наиболее существенной должна быть последовательность изменений: снижение митохондриального дыхания (потребления О₂) → внутриклеточная гипероксия → усиление ПОЛ мембран, прежде всего мембран митохондрий → падение в них уровня легкоокисляемого кардиолипина. Последнее, в свою очередь, создает положительную обратную связь по поддержанию в стареющих и старых клетках (в данном случае сердца крыс) ослабленного дыхания и свободнорадикального окислительного стресса.

Из цитированных выше и ряда других работ (Alemany et al., 1988; Kim et al., 1988) следует, что энергообеспеченность стареющих клеток и тканей недостаточна из-за снижения активности митохондрий и (или) ограниченности числа полноценных этих оранелл. Дефицит АТР должен соответствующим образом отразиться на биосинтетических процессах, исполнении различных физиологических функций. Так, адаптивное усиление гликолиза в связи со снижением содержания АТР в старости объясняется ослаблением эффекта Пастера. В основе последнего лежат механизмы аллостерического ингибирования гексокиназы глюкозо-6-фосфатом и фосфофруктокиназы продуктом АТР, поэтому при дефиците АТР активность указанных ферментов повышается (Богацкая, 1968). Другой пример – нарушение в процессе старения функционирования нейронов из-за снижения числа активно действующих митохондрий и, следовательно, недостаточности требуемой им энергии. Такой факт установлен, в частности, при исследовании морфофункциональных изменений в митохондриях клеток Пуркине мозжечка крыс Wistar 3-, 12- и 24-месячного возраста (Fattoretti et al., 1996). Но главные негативные последствия должны определяться не дефицитом АТР и сАМР, а, скорее всего, возникающим при старении клеток состоянием пероксигенации. Например, снижение энергетической активности митохондрий в клетках мочевого пузыря крыс 30-месячного возраста может приводить к ухудшению функциональных возможностей всего органа вследствие того, что повышается вероятность повреждения его тканей избыточными АФК (Tong-Long et al., 1998).

1.3.4. Значение сАМР как вторичного внутриклеточного мессенджера, участвующего в реализации многих важных биохимических процессов, в основном антипролиферативных, хорошо известно. Роль его сводится к активации протеинкиназы А по уравнению

RC + cAMP → R cAMP + C,

где RC – протеинкиназа А; R – её регуляторная субъединица; С – субъединица, катализирующая фосфорилирование соответствующих белков. С возрастом способность клеток к синтезу сАМР должна в принципе снижаться. Во всяком случае, такой факт установлен для лимфоцитов (Krall et al., 1987). Одной из причин этого сдвига может быть дефицит АТР, из которого как раз и образуется сАМР. Последний в норме является мощным стимулятором митохондриального дыхания (см. Лю, Шайхутдинов, 1991 – п.1.1.11, а также п.2.1.9 в данной моногафии), усилителем энергообразования (Федоров и др., 1990). При недостатке этого циклонуклеотида зависимое от него дыхание должно ослабляться, усугубляя гипероксическое и пероксидантное состояние в соответствующих клетках. В этом смысле снижение концентраций АТР и сАМР способно «работать» на старение клеток и тканей. Возрастное снижение уровня сАМР может определяться и другими причинами, связанными, прежде всего, с распространением перекисного окисления на липиды плазматической мембраны клеток и инактивацией встроенной в неё аденилатциклазы – фермента, катализирующего синтез сАМР из АТР. Справедливость данного механизма можно аргументировать следующими фактами.

При старении изменяются химический состав и упорядоченность липидного бислоя плазматической мембраны, повышается её микровязкость за счёт модификации фосфолипидного состава. Считают, что вообще «модификация структуры плазматической мембраны – один из наиболее вероятных механизмов нарушения регуляции тканевого метаболизма при старении» (Гацко и др., 1988). Златанов (Zlatanov, 1989), исследуя плазматическую мембрану из клеток яичка крыс, установил: с возрастом «жесткость» мембраны и содержание перекисных продуктов в ней увеличиваются, а чувствительность аданилатциклазной системы к гормональным и негормональным активаторам понижается. Возрастное снижение активности аденилатциклазы в мембранах разных типов клеток (Robberecht et al., 1986; Конопля и др., 1991) так или иначе обусловлено изменениями в её липидном микроокружении при развитии ПОЛ и тем, что коммуникаторами, связывающими рецепторную и каталитическую субъединицы аденилатциклазы, являются легкоокисляемые фосфатидилинозит и фосфатидилсерин (Петров и др., 1983).

Возникающие при ПОЛ изменения приводят, по-видимому, к модификации регуляторных функций белка G_S, нарушению сопряжения G_S c β-адренорецеп-тором (Ikeda, Saita, 1989a) или с каталитической субъединицей аденилатциклазы (Ikeda, Saita, 1989, 1989a).Это мнение, похоже, подтверждается данными о том, что в остеобластах молодых (4 мес.) крыс накопление сАМР под влиянием паратгормона было в 3 раза сильнее, чем в тех же клетках взрослых (12 мес.) и старых (24-28 мес.) животных. Снижение реакции на паратгормон объясняется возрастным дефектом связывания стимуляторного белка G_S с аденилатциклазой (Donahue et al., 1997). В любом случае все эти сдвиги индуцируются в условиях пероксидации. Через этапы снижения концентрации сАМР и скорости дыхания они снова выходят на себя, образуя ещё один замкнутый контур регуляции с положительной обратной связью по развитию условий «пероксидативного» старения клетки (см. рис. 3). Укажем и на следующий факт. У крыс Sprague-Dawley в возрасте 19 мес. базальная активность аденилатциклазы фракции мембран мозжечка была по сравнению с её активностью у 9-недельных животных снижена с 117 до 94 пмоль/мин на 1 мг белка. Одновременно у стареющих крыс в большей степени, чем у молодых, была уменьшена концентрация β-адре-норецепторов (Slotkin et al., 1998).

По другим данным, при старении изменяется в целом сама система, регулирующая деление клетки с помощью циклических нуклеотидов. Прежде всего, нарушается соотношение концентраций сАМР/cGMP. Например, в лимфоцитах старых мышей соотношение сАМР/cGMP в 20 раз меньше такового у молодых (см. Войтенко, Полюхов, 1986). Подобные факты при гипероксии и пероксидации в стареющих клетках естественно объяснить снижением уровня сАМР (см. выше) и возрастанием уровня сGМР за счёт активации гуанилатциклазы в указанных условиях (см. п.2.3.2).

 (ПО-АО)

ПОЛ плазматической мембраны

Возрастание внутриклеточного рО₂ и дисбаланса  (ПО-АО)

Инактивизация липидозависимой аденилатциклазы

Уменьшение содержания сАМР

в клетке

Снижение дыхания, стимулируемого сАМР

 (ПО-АО)

Рис.3. Система поддержания возрастного снижения уровня сАМР в клетке и условий для ее старения

ПОЛ плазматической мембраны

Снижение

активности

5-нуклео-тидазы

Рис.4. Cистема поддержания «пероксидативного» старения клетки путем активации АФК-продуцирующих фагоцитов

Внеклеточный АМР

Падение уровня

аденозина

Повышение подавляемой аденозином активности фагоцитов

Увеличение фагоцитами продукции

АФК

Уменьшение содержания сАМР в клетке

Далее по схеме на рис.3

Падение активности 5´-нуклеотидазы при старении также связывают с модификацией липидного состава плазматической мембраны, на которой локализован этот фермент (Narayanan, Derby, 1982; Конопля и др., 1991). Если считать, что такое изменение не является тканеспецифичным, то возможно существование одного интересного, на наш взгляд, дополнительного механизма «в поддержку» старения. Для понимания его сути примем во внимание следующие моменты: необратимое дефосфорилирование внеклеточного АМР до аденозина при участии 5´-нуклеотидазы и транспорт аденозина в клетки (см. Конопля и др., 1991); увеличение аденозином содержания сАМР в клетках и подавление им функциональной активности естественных киллеров (ЕК-клеток) и мононуклеарных фагоцитов (Si et al., 1997; Xaus et al., 1999). C учётом этих фактов на рис.4 представлена соответствующая система, замкнутая положительной обратной связью. По существу, она представляет модернизированный вариант рассмотренного в п.1.1.2 «фагоцитарного» механизма старения, который в целом играет всё же второстепенную роль.

При старении страдают и процессы активного транспорта ионов, требующие затрат энергии при распаде АТР. Нарушения такого рода обусловлены не только возрастным дефицитом АТР, но и сдвигами в микроокружении и топографии соответствующих ферментов, дестабилизацией структуры плазматической мембраны и усилением в ней ПОЛ, непосредственным ингибированием перекисями липидов ферментов. Сказанное касается, например, Nа⁺/К⁺-АТРазы и Са²⁺-АТРазы, активность которых падает при старении (Narayanan, Derby, 1982; Садовникова, 1986).В результате процесс удаления ионов Na⁺ и Са²⁺ из клетки ослабляется и концентрация их в цитоплазме увеличивается. Показано (на примере эндотелиальных клеток аорты свиней), что в снижении активности Nа⁺/К⁺-АТРазы участвует и сАМР, инактивируя фермент путём сАМР-зависи-мого фосфорилирования его α-субъединицы (Gruwel et al., 1998; Муртазина и др., 2001). С учётом дефицита сАМР в старых клетках, данный эффект, казалось бы, не должен приводить к заметному падению в них активности Nа⁺/К⁺-АТРазы. Поскольку такое изменение всё-таки происходит, значит, активность этого фермента ограничивают какие-то другие факторы, и одним из таковых, вероятнее всего, является дефицит АТР.

С указанными фактами не согласуются данные о повышенной активности Nа⁺/К⁺-АТРазы в синаптосомах мозга мышей линии SAMP с ускоренным процессом старения ( по сравнению с резистентной к старению линией SAMR). Как отмечают авторы этого сообщения (Докторова и др., 1999), «активация Nа⁺/К⁺-АТРазы вызвана изменением свойств липидного окружения фермента и отражает адаптационный ответ мозга на повышеннную генерацию свободных радикалов в тканях». Механизм, по которому АФК, ПОЛ и недостаточный уровень АТР не приводят, в отличие от большинства других случаев, к снижению липидозависимой Nа⁺/К⁺-АТРазы, а наоборот, повышают её, не совсем понятен. Возможно, синаптосомальные мембраны мозга в этом отношении составляют исключение, и для них существует какой-то механизм, инвертирующий знак эффекта Nа⁺/К⁺-АТРазы на обратный.

Возрастная неэффективность Са²⁺-транспортирующего механизма может, в свою очередь, повысить скорость «пероксидативного» старения ввиду известной способности Са²⁺ активировать фосфолипазу А₂. Рост концентрации натрия в клетке также не остаётся без последствий. Правда, некоторые сторонники мембранной гипотезы старения, считающие основной причиной его действие свободных радикалов на плазматическую мембрану (см. п.1.4), увеличение концентрации натрия в клетке объясняют по своему логично – резким повышением проницаемости указанной мембраны и усилением пассивной диффузии ионов Nа⁺. Это приводит к увеличению микровязкости и плотности цитоплазмы, что служит причиной возрастного снижения интенсивности синтетической активности в клетке (Damjanovich et al., 1989). С точки же зрения нашей концепции, ионная асимметрия нарушается по обоим указанным механизмам, однако, вклад их на ранних и поздних стадиях онтогенеза различен.

Состояние «пероксидативного» старения клеток с нарушением энергообмена может моделироваться путём искусственного создания антиоксидантной недостаточности. В одной из таких работ исключением из рациона белых крыс витамина Е изучали взаимосвязь ПОЛ с состоянием некоторых биоэнергетических процессов в сердце и печени животных. Об активации ПОЛ, повреждающим структуру и функции клеточных мембран, судили по усилению образования диеновых конъюгатов и MDA. При этом уменьшалось содержание адениловых нуклеотидов: уровень АТР в печени был снижен на 33 %, а уровни АТР, ADP и АМР в сердце – соответственно на 53.9, 40.6 и 67.4 %. Фармакокоррегирующие воздействия антиоксидантами различной природы способствовали нормализации показателей ПОЛ и энергетического обмена, упорядочению метаболизма клеточных мембран (Юрженко и др., 1988). Не исключено, что отмеченные изменения как-то связаны с упомянутыми выше падениями активности 5΄-нуклеотидазы, уровней аденозина и сАМР при развитии ПОЛ плазматической мембраны клеток.

Таким образом, концепция старения клетки, основанная на первичности поражения антикислородной ступени защиты в «лице» митохондрий, в целом представляется достаточно обоснованной и подтверждается рядом других заслуживающих внимания фактов. Например, путём анализа жирных кислот из митохондрий восьми видов млекопитающих с максимальной продолжительностью жизни 3.5 – 46 лет было показано, что общее число двойных связей и индекс перекисной окисляемости связаны с указанной продолжительностью жизни обратной зависимостью (r = –0,88, р < 0,003). У долгоживущих животных такой характер связи опосредован не низким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, а, как полагают (Pamplona et al., 1998), перераспределением некоторых их типов. Поскольку возрастные изменения начинаются с основных энергопродуцирующих органелл и в дальнейшем продолжают определяться их состоянием, имеет смысл называть кислородно-перекисную концепцию старения ещё и «патоэнергетической».

Следует учитывать также, что вообще вклад митохондрий в физиологию клеток животных намного значительнее, чет принято об этом считать. Помимо свой основной функции – продукции АТР, они выступают в роли различных датчиков и регуляторных устройств. Например, по данным недавнего обзора (Duchen, 1999), митохондрии участвуют в создании гомеостаза глюкозы в качестве датчика состояния субстратов, способствующих секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы. Они же в качестве датчика наличия О₂ причастны к регуляции дыхательных процессов в клетке. На многие Са²⁺-зависимые реакции существенное влияние оказывает депонирование Са²⁺ в митохондриях. С дисфункцией же последних связаны необратимые процессы апоптоза и некроза клеток (см. также п.7.1). _.В последующих параграфах данной главы на основе принципа первичности расстройства биоэнергетики анализируются и интерпретируются ряд других проявлений старения и наиболее распространённые возрастные патологии.